1) A mikroszomális inkubálások során a NADPH hozzáadásával képződő metabolitok monooxigenáz enzim- (CYP vagy flavin monooxigenáz enzimek) reakciót jelentenek, míg a mikroszóma-preparátum 45 °C-os hőkezelése után is képződő metabolitok a CYP enzimek működésének köszönhetőek. Az egyes CYP enzimek azonosítása CYP-szelektív gátlószerek jelenlétében a gátlószermentes inkubálás során való metabolittermelődéshez viszonyítva történik. Széles, CYP-szelektív gátlószerkínálat áll rendelkezésre (2. táblázat), azonban a gyakorlatban eltérően kell kezelni a mechanizmusalapú gátlószereket (pl. CYP3A4-gátló troleandomicin) és a reverzibilis gátlószereket (pl. CYP3A4-gátló ketokonazol). A mechanizmusalapú gátlószer metabolizmusa során képződő termék nem disszociál az enzimről, és a képződő metabolikus intermedierkomplex irreverzibilisen gátolja az enzimet. Ebből következően a gyakorlatban a májmikroszóma-preparátummal és például a troleandomicinnel 20 perces előinkubálást végeztünk, mielőtt a vizsgálandó gyógyszerjelöltet a reakcióelegyhez adtuk. Ez az idő elegendő volt ahhoz, hogy kialakuljon a metabolikus intermedierkomplex a CYP3A4 enzimmel. A ketokonazol kompetitív CYP3A gátlószer alkalmazásakor nincs szükség előinkubálásra, ami leegyszerűsíti a vizsgálatot a gyakorlatban. A gátlás mértékének (IC50, Ki) megállapítása különböző koncentrációban alkalmazott hatóanyag/szubsztrát és CYP-szelektív gátlószer mellett történik. Az LK-935-metabolitok képződéséért felelős enzimek azonosítása után a gátlás Ki értékeit is meghatároztuk. A deramciklan metabolikus lépéseit elsősorban katalizáló CYP2E1 szerepét izoniaziddal kezelt (50 mg/kg) és kezeletlen patkányok májából izolált mikroszómával való inkubálás során is teszteltük. A p-nitrofenol hidroxilezésében, valamint a 7-hidroxi-4-trifluormetil-kumarin O‑demetilezésében részt vevő enzimek tesztelése után az érdemi gátolhatóságot mutató enzimeknél meghatároztuk a Ki értékeket is. A vizsgálatok módszertani részletei publikált munkákban megtalálhatók (D2, D5-7).

2) A cDNS-expresszált egyedi CYP enzimeket tartalmazó mikroszóma-preparátumok (Supersomes) az adott CYP enzimen kívül a NADPH-citokróm P450-reduktázt is tartalmazták; a CYP enzimek megfelelő működéséhez pedig a reakcióelegyet kiegészítettük NADPH-val. cDNS-expresszált CYP2E1 enzim alkalmazásával megerősítettük a CYP-szelektív gátlószerekkel végzett májmikroszomális deramciklan-enzimtérképezés eredményeit. Továbbá cDNS-expresszált humán CYP-panelt (CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1, CYP3A4) használtunk a 7-hidroxi-4-trifluormetil-kumarin O‑demetilezésében részt vevő enzimek azonosítására (részletek a D5 és D7 publikációkban találhatók.

3) A CYP enzimek szerepének tisztázására a 7-hidroxi-4-trifluormetil-kumarin O‑demetilezésében, valamint a paracetamol reaktív metabolitjának képződésében egy további megközelítést – a kérdéses reakció és a klasszikus CYP-marker-aktivitások (1. táblázat) összehasonlítását humán mikroszómapanelen – is alkalmaztunk (részletek a D7 és D8 publikációban).