Az LK-935 in vitro farmakokinetikai viselkedését és a májsejtekben képződött metabolitok szerkezete alapján felállított metabolizmus-útvonalakat az előző fejezetekben ismertettem (lásd 4.1.1. és 4.1.2.) (D2). Humán májmikroszómában történő metabolizmus során az LK-935 metabolitok kizárólag akkor képződtek, ha NADPH-t is tartalmazott az inkubációs elegy, ami a monooxigenáz enzimek aktivitására világított rá. Az azonos kofaktor- (NADPH) igény miatt a flavin monooxigenázok és a CYP enzimek aktivitásának elkülönítésére a kétféle monooxigenáz eltérő hőérzékenységét használtuk ki. A májmikroszóma-preparátum 45 °C-os előkezelése nem befolyásolta az LK-935-metabolitok képződését, ami kizárta a hőérzékeny flavin monooxigenázok aktív közreműködését. Az egyes metabolikus lépéseket katalizáló CYP enzimek aktivitását CYP-szelektív kémiai gátlószerekkel azonosítottuk. A CYP2C9-szelektív szulfafenazol és a CYP3A4-szelektív ketokonazol jelenlétében szignifikánsan csökkent az LK‑935-metabolitok termelődése, míg a CYP2B6 és CYP2C19 enzimek gátlása nem befolyásolta az LK-935 metabolizmusát. Különböző CYP2C9- és CYP3A4-gátlószer, illetve LK‑935-koncentrációk alkalmazásával (a Ki gátlási állandók meghatározásával) megállapítottuk (12. ábra), hogy 1) a propiloldallánc lehasadását mind a CYP2C9, mind a CYP3A4 enzim katalizálta, 2) a hidroxietil-piridin lehasadása a CYP3A4 aktivitásának volt köszönhető, 3) a propiloldallánc hidroxilezését kizárólag a CYP2C9 enzim végezte, míg 4) a piridingyűrű hidroxilezését mindkét enzim katalizálta, bár a CYP3A4 egy nagyságrenddel magasabb Ki mellett (részletek a D2 publikációban).

A deramciklan metabolizmusában szerepet játszó CYP enzimek azonosítását hasonló módon végeztük (D5), mint a fentiekben bemutatott LK-935 gyógyszerjelölt enzimtérképezését. Mivel patkány és humán primer hepatocitákban a deramciklan metabolizmusa hasonlónak bizonyult (a részleteket a Függelék F.1. ábrája és a S20 publikáció tartalmazza), az enzimtérképezést mindkét fajból származó májmikroszómán elvégeztük. A CYP-szelektív gátlószerek (CYP1A2: α-naftoflavon; CYP2C9: szulfafenazol; CYP2D6: kinidin; CYP2E1: dietil-ditiokarbamát; CYP3A4: troleandomicin) több CYP enzim szerepére is rávilágítottak a deramciklan oldalláncának módosításában (N‑dezmetil deramciklan, fenilborneol-képződés), illetve a molekula hidroxilezésében (a kámforrész metilcsoportján vagy a kámforgyűrű szénatomjain), azonban a CYP2E1 enzim jelentőségét külön ki kell emelni. Dietil-ditiokarbamát (CYP2E1-szelektív gátlószer) jelenlétében a deramciklan-metabolitok képződése jelentősen visszaszorult, míg az izoniaziddal (CYP2E1-szelektív induktorral) kezelt patkányokból származó májmikroszóma-preparátumok számos metabolit (fenilborneol, hidroxi-deramciklan és N-dezmetil hidroxi-deramciklan-metabolitok) fokozott termelődéséhez vezettek. Nem ritka, hogy egy vegyület szubsztrátja valamely CYP enzimnek és egyben gátolja is az adott enzim működését, ezért kézenfekvő volt a kérdés, hogy a deramciklan vagy fő metabolitja, a N-dezmetil deramciklan befolyásolja-e a CYP2E1 aktivitását. Humán májmikroszómában igazoltuk, hogy sem az anyavegyület, sem N‑demetilezett metabolitja közvetlenül nem okozott változást a CYP2E1‑szelektív klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitásban. A mechanizmusalapú gátlás tesztelésére is van lehetőség a gyógyszerjelölttel végzett előinkubálás után történő CYP-szelektív enzimreakció vizsgálatával. A deramciklannal vagy metabolitjával, a N-dezmetil deramciklannal végzett előinkubálás során olyan metabolit vagy metabolitok képződtek, amelyek gátolták a CYP2E1 aktivitását (Ki: 39,3 ± 4,0 μM).

A CYP enzimek aktivitásának jellemzésére rendkívül előnyös olyan szubsztrátot és reakciót választani, amelynek során a képződő metabolit detektálása egyszerű fotometriás vagy fluoreszcencia méréssel megoldható, azonban mindenképp szükséges igazolni a reakció CYP-szelektivitását és alkalmazhatóságát az in vitro kísérleti körülmények között (májmikroszómán, hepatocitákon vagy cDNS-expresszált CYP enzimeken). Egyszerűsége miatt a p-nitrofenol hidroxilezését, valamint a 7-metoxi-4-trifluormetil-kumarin O-demetilezését előszeretettel javasolták a CYP2E1, illetve a CYP2C9 enzim aktivitásának meghatározására (Reinke, 1985; Koop, 1989; Crespi, 2002). A p‑nitrofenolból képződő 4-nitro-katekol mennyisége fotometriásan, míg a 7-metoxi-4-trifluormetil-kumarinból képződő 7-hidroxi-4‑trifluormetil-kumarin fluoreszcenciaméréssel gyorsan és egyszerűen meghatározható (Függelék, F.2. ábra). Májmikroszómában végzett vizsgálataink alapján azonban kételyek merültek fel a két szubsztrát CYP2E1-, illetve CYP2C9-szelektivitásával kapcsolatban. CYP-szelektív kémiai gátlószerekkel történő enzimtérképezés alapján megállapítottuk, hogy a p-nitrofenol hidroxilezéséhez a CYP2E1 mellett a CYP2A6 és a CYP2C19 enzimek is nagymértékben hozzájárultak, így a p‑nitrofenol nem használható CYP2E1-szelektív próbaszubsztrátként májmikroszómális vagy hepatocita CYP2E1-aktivitás jellemzésére (D6). Továbbá a 7-metoxi-4‑trifluormetil-kumarin sem tekinthető CYP2C9-szelektív próbaszubsztrátnak. CYP-szelektív gátlószerekkel végzett enzimtérképezés alapján a vegyület O‑demetilezése sokkal inkább volt több CYP-enzim (CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1, CYP3A4), mint a CYP2C9 specifikus aktivitásának köszönhető (D7). Az enzimtérképezés eredményeit megerősítettük 1) humán májmikroszóma-panel (32 donorból származó) CYP-marker aktivitásainak és 7-metoxi-4‑trifluormetil-kumarin O‑demetiláz-aktivitásának korrelációs analízisével, valamint 2) cDNS-expresszált egyedi humán CYP enzimek 7‑metoxi-4‑trifluormetil-kumarin O‑demetiláz-aktivitásának vizsgálatával is. A 7‑metoxi-4‑trifluormetil-kumarin O‑demetiláz-, valamint a humán CYP-szelektív enzimaktivitások (CYP2A6: kumarin 7-hidroxiláz; CYP2B6: S-mefenitoin N-demetiláz; CYP2C9: tolbutamid 4‑hidroxiláz; CYP2C19: S-mefenitoin 4’-hidroxiláz; CYP2E1: klórzoxazon 6-hidroxiláz; CYP3A4: midazolam 4‑hidroxiláz) közti többszörös összehasonlítás szignifikáns összefüggést jelzett (N = 32, r2 = 0,8478, P < 0,0001). Korreláció volt kimutatható a 7‑metoxi-4‑trifluormetil-kumarin O‑demetiláz- és a CYP2B6-, illetve a CYP2E1-marker-aktivitások között (r = 0,7496 és 0,7969, P < 0,01). A cDNS-expresszált humán CYP enzimekkel végzett metabolizmus eredményei alapján megállapítható volt, hogy a CYP2E1 jelentős mértékben, a CYP2C19, CYP2C9 és CYP2B6 enzimek kisebb mértékben járultak hozzá a 7‑metoxi-4‑trifluormetil-kumarin O‑demetilezéséhez (CYP2E1: 59,5%, CYP2C19: 16,7%, CYP2C9: 14,1%, CYP2B6: 7,4%). Mindezek megerősítették, hogy a 7‑metoxi-4‑trifluormetil-kumarin nem CYP2C9-szelektív szubsztrát.