Kutatócsoportunkban (MTA Kémiai Kutatóközpont/Természettudományi Kutatóközpont) Magyarországon elsőként kezdtük meg az in vitro májmodellek (primermájsejt- és májmikroszóma-modellek) alkalmazását a gyógyszerjelölt hatóanyagok biológiai stabilitásának meghatározására, az in vivo farmakokinetikai paraméterek becslésére és a metabolikus útvonalak feltárására. Forgalomban lévő pszichofarmakonok példáján keresztül igazoltuk, hogy a primer májsejt-modellben nyert farmakokinetikai paraméterek és az azokból becsülhető humán biohasznosulás jó egyezést mutatott a klinikai adatokkal, azaz jó a primer májsejt-modell in vivo predikciós értéke (D1). A laboratóriumi állatokból és humán májszövetből izolált hepatocitákban tapasztalt „clearance”-érték-eltérések azonban arra hívták fel a figyelmet, hogy a faji különbségekkel számolni kell az állatról emberre történő extrapoláció során. A humán májsejteken nyert információk rávilágíthatnak a hatóanyagok olyan sajátságaira is, amelyek a biztonsági vizsgálatok során a laboratóriumi állatokon nyert adatok alapján elkerülnék a figyelmet, ahogy azt Lombardo és munkatársai (2021) megállapították a D1 publikáció nyomán. A patkány primer májsejteket emberre nézve relevánsnak tekintettük, míg a kutya és nyúl hepatocitákban zajló metabolizmus jelentősen eltért az emberétől. A panomifen (Egis Gyógyszergyár Zrt.) májmikroszómális metabolizmusa azonban már nem erősítette a patkány-humán hasonlóságot, a humán specifikus panomifen-metabolit képződése pedig nehézséget jelenthet a toxikológiai vizsgálatok értékelése során (D4). Coleman és munkatársai (2001) szerint az emberre történő extrapoláció kizárólag az állatokfajokon nyert adatok alapján valós kockázatot rejt magában, amelyre példaként említették a panomifent. Ugyanakkor ha az in vitro modellek alapján a korai fejlesztési fázisban már ismertté válnak a laboratóriumi állatok és az ember farmakokinetikai és metabolizmuskülönbségei, az hozzájárulhat a biztonsági vizsgálatok eredményeinek értelmezéséhez.

A hatóanyagok átalakítását katalizáló CYP enzimek azonosítása alapján megbecsülhető, hogy a klinikai alkalmazás során számíthatunk-e polimorf metabolizmusra vagy CYP-gátló, illetve -indukáló vegyület jelenlétében a hatóanyag farmakokinetikai viselkedésének megváltozására. Ugyanis a hatóanyagok metabolizmusában részt vevő enzimek expressziójában és/vagy aktivitásában történő esetleges változások kihatással lehetnek a gyógyszerhatékonyságra és a nem kívánt mellékhatások kialakulására (Shah, 2015a; Hahn, 2021; Magro, 2021). Különösen lényeges ez akkor, ha az adott gyógyszerhatóanyag biotranszformációját egyetlen enzim katalizálja. A humán májmikroszóma-preparátumok alkalmas in vitro modellt jelentenek az enzimtérképezéshez, amelyet kutatócsoportunkban CYP-szelektív kémiai gátlószerekkel végzünk. Enzimtérképezéssel igazoltuk, hogy az LK-935 (Lek Pharmaceuticals d.d.) metabolizmusát a CYP3A4 és CYP2C9 enzimek katalizálják (D2), amiből gyanítható, hogy az LK-935 klinikai alkalmazása során különbségekre lehet számítani a CYP2C9 genetikai polimorfizmusa miatt, valamint a párhuzamosan alkalmazott CYP2C9- és CYP3A4-induktor- vagy -gátló hatású gyógyszerhatóanyagok miatt, amire a gyógyszerfejlesztéssel kapcsolatos összefoglaló munkájukban Zhou és munktársai (2009a) is felhívták a figyelmet a D2 alapján. A deramciklan metabolizmusához ugyan több CYP enzim is hozzájárult, azonban a CYP2E1 domináns szerepét igazoltuk (D5), ezért feltételezhető, hogy a deramciklan betegeknél történő alkalmazása során a CYP2E1 működését befolyásoló tényezők (pl. CYP2E1-indukáló hatás: éhezés, alkoholfogyasztás) módosíthatják az eliminációját. Míg a deramciklanból képződő metabolit(ok) CYP2E1-gátló hatása abban az esetben juthat érvényre, akkor változtatja meg a CYP2E1-szubsztrátok (pl. klórzoxazon) farmakokinetikai viselkedését, ha a deramciklan terápiás vérkoncentrációja összemérhető a CYP2E1 gátlási állandójával. Ugyancsak CYP-enzimtérképezéssel állapítottuk meg, hogy a CYP2E1-szelektív szubsztrátnak tartott p‑nitrofenol hidroxilezését nemcsak a CYP2E1, de a CYP2A6 és CYP2C19 enzimek is katalizálják, így nem alkalmazható CYP2E1-aktivitást jellemző markerreakcióban (D6). Továbbá igazoltuk, hogy a p-nitrofenol hidroxiláz aktivitás gátlása alapján CYP2E1-gátlószernek tekintett vegyületek (klotrimazol, mikonazol, klórpromazin, tioridazin, flufenazin, diklofenak) valójában nem annyira a CYP2E1, hanem egyéb CYP enzimek aktivitását gátolták, ezért a farmakokinetikai gyógyszer-kölcsönhatásaik újraértékelése szükséges. Az eredményinkre hivatkozva Niwa és munkatársai (2005) antifungális szerek CYP-gátló sajátságairól szóló munkájukban külön hangsúlyozták, hogy a mikonazol p‑nitrofenol hidroxiláz aktivitást gátló hatása nem kizárólag a CYP2E1-aktivitás gátlásával magyarázható. Hasonló módon bizonyítottuk, hogy a 7-metoxi-4-trifluormetil-kumarin nem tekinthető CYP2C9-szelektív szubsztrátnak, hiszen a CYP2E1, a CYP2C19 és a CYP2B6 is hozzájárult az O-demetilezéséhez (D7). Ezért a 7‑metoxi-4‑trifluormetil-kumarin heterogén, több CYP enzimet expresszáló rendszerekben (pl. májmikroszóma, hepatocita) – bármennyire is szeretnénk – nem használható CYP-izoenzim-szelektív aktivitás jellemzésére.

A gyógyszerbiztonság megteremtéséhez szintén hozzátartozik a farmakokinetikai gyógyszer-kölcsönhatások – a CYP-enzim-indukció és CYP-enzim-gátlás – előrejelzése. A primer májsejtek ugyancsak alkalmas in vitro modellt jelenthetnek a CYP-indukció vizsgálatához, míg a hatóanyagok CYP-gátló képessége májmikroszómában tesztelhető. A koleszterinszint-csökkentő sztatinok szinte mindegyike farmakokinetikai gyógyszer-kölcsönhatások kiváltója, ezért indokolt volt az új hatóanyagok (LK-935, LK-980) CYP-indukáló sajátságainak tesztelése (D2, D3). Az LK‑935 humán daganatos sejtvonalban (HepG2) mutatott, a rifampicinnel összemérhető PXR-aktiváló képessége erőteljes CYP3A4-indukciót és CYP3A4-szubsztrátokkal való kölcsönhatást vetített előre. Humán primer hepatocitákban azonban az LK‑935 CYP3A4-indukáló képessége messze elmaradt a rifampicinétől, ami a gyors LK-935-metabolizmussal volt magyarázható. Az LK-980 pedig egyáltalán nem okozott CYP3A4-indukciót primer májsejtekben, ami mindenképp előnyös sajátság a sztatinokkal szemben. A nukleárisreceptor-aktiválással kiváltott CYP-gén-transzkripció-fokozódás jól nyomon követhető volt humán májsejtekben, azonban a látszólagos CYP2E1-indukció igazolása nem tűnt ennyire egyértelműnek, mivel a primer májsejtek folyamatosan veszítettek CYP2E1-tartalmukból (D9). Ezért célszerű volt több ismert CYP2E1-induktor vegyület CYP2E1 enzimfehérje-stabilizáló hatását is tesztelni a referenciavegyület kiválasztásához. Az imidazol – mint hatékony CYP2E1-induktor – alkalmazható referenciaként a gyógyszerjelöltek CYP2E1-indukáló sajátságának vizsgálata során. A GYKI-47261 jelű vegyület (IVAX Gyógyszerkutató Intézet) az imidazolt meghaladó mértékben stabilizálta a CYP2E1 fehérjét, és ezzel a kezeletlen sejtekhez képest fokozott CYP2E1-aktivitást idézett elő, ami nem járt együtt a CYP2E1-transzkripció fokozódásával. A GYKI‑47261 CYP2E1-indukáló képessége magyarázható a vegyület imidazolrészével, bár a molekula egyéb részei is hozzájárulhattak a CYP2E1 stabilizálásához, hiszen a GYKI-47261 hatékonyabb CYP2E1-induktornak bizonyult, mint az imidazol.

A bemutatott in vitro modellek és metodikák nemcsak gyógyszerjelöltek, de forgalomban lévő hatóanyagok farmakokinetikai gyógyszer-kölcsönhatásainak felderítésére is alkalmazhatók. Így került az érdeklődésünk középpontjába az állatgyógyászatban használt két antibiotikum, a tiamulin és a monensin: a kombinált alkalmazásuk során fellépő súlyos mellékhatások hátterében gyógyszer-kölcsönhatásokat tártuk fel (D10). Bár a CYP-indukció vizsgálatát in vivo patkánymodellen végeztük, az enzimtérképezést, a CYP-gátlást és a metabolikus intermedierkomplex-képződést in vitro máj mikroszóma-preparátumon tanulmányoztuk. Kimutattuk, hogy a tiamulin kettős hatást gyakorolt a CYP3A enzimekre, indukálta a CYP3A-expressziót és közvetlenül gátolta a CYP3A-működést metabolikus intermedierkomplex képződése nélkül, azonban a monensinnel való kölcsönhatásban és a toxikus tünetek kialakulásában a CYP3A-gátlásnak van meghatározó szerepe. A tiamulin okozta monensinmetabolizmus-gátlás veszélyeire külön figyelmeztetett az EFSA (European Food Safety Authorities) a monensinről összeállított anyagában (Alexander, 2008; EFSA Panel on FEEDAP, 2019). Egy másik igen érdekes gyógyszer-kölcsönhatás vizsgálatunk főszereplője a paracetamol volt (D8). A paracetamolmérgezés okozta májkárosodás mérséklésére az antidótumterápia mellett a reaktív paracetamolmetabolit, a NAPQI képződésének csökkentése is alkalmas lehet, így a szervezet időt nyerhet a méregtelenítő folyamatokhoz szükséges kofaktorok pótlására. Azonban a klinikai gyakorlatban használt CYP-gátló cimetidinről kimutattuk, hogy nem akadályozta meg a NAPQI-termelődést, mivel nem gátolta a reaktív metabolit képződéséért felelős CYP2E1 és/vagy CYP2A6 enzimeket. Ugyanakkor javaslatot tettünk arra, hogy a 4-metilpirazol és a diszulfiram CYP2E1-gátló és NAPQI-t csökkentő tulajdonságát érdemes lenne kihasználni a paracetamolmérgezés korai időszakában. A NAPQI-képződés gátlása, mint kezelési stratégia, azóta ajánlásként megfogalmazódott a klinikai gyakorlatban (Langhammer, 2014; Akakpo, 2020), sőt paracetamolmérgezés esetén a 4‑metilpirazolt sikerrel alkalmazták betegeknél (Shah, 2020; Shah, 2021; Akakpo, 2022).

A kutatócsoportunkban meghonosított és finomhangolt primer májsejt-, illetve májmikroszóma-modellek, valamint az in vitro farmakokinetikai, metabolizmus és gyógyszer-kölcsönhatás vizsgálatok ma már az FDA és az EMA (Európai Gyógyszerügynökség, European Medicines Agency) ajánlásaiban is szerepelnek (Sudsakorn, 2020). A vizsgálatok eredményei segíthetik 1) a gyógyszerjelölt in vivo várható kinetikai viselkedésének becslését, az emberhez farmakokinetikai szempontból leginkább hasonlító állatfaj azonosítását, humán specifikus metabolit(ok) képződésének igazolását vagy kizárását, valamint a biztonsági (toxikológiai) vizsgálati eredmények értelmezését, 2) a klinikai alkalmazás során várható polimorf metabolizmus és a farmakokinetikai gyógyszer-kölcsönhatások kockázatának megítélését.