A vezérmolekula-keresés során az in vitro hatékonyság az egyik legfontosabb szempont. Bár a hatékonyság javítása érdekében tett erőfeszítések a legtöbb esetben indokoltak, mégsem állítható, hogy egy vegyületcsalád leghatékonyabb tagja szükségszerűen vezérmolekula lehet. Az in vitro hatékonyság vizsgálatát általában több szinten is célszerű elvégezni. A legegyszerűbb tesztek a kismolekula-makromolekula kölcsönhatás detektálására törekednek, amit legtöbbször kompetitív radioligand kötődési tesztekkel, illetve enzimek esetében gátlási tesztekkel valósíthatunk meg (2.2. fejezet). Az elmúlt években elterjedté váltak a legkülönbözőbb biofizikai elven alapuló detektálási módszerek (3.3. fejezet). A célponttal való kölcsönhatás bizonyítása mellett ugyanakkor szükség van annak igazolására is, hogy a vegyület a célpont működését a kívánt irányban befolyásolja. Ennek érdekében a vegyületek hatékonyságát funkcionális tesztekben is szükséges vizsgálnunk. Számos esetben szükség van a vegyület élő sejteken mutatott hatékonyságának vizsgálatára is. A hatékonyság in vitro vizsgálata során az egyik alapvető kérdés a célpont, illetve a célpontot kifejező sejtes rendszer eredete. Az esetek többségében az elsődleges tesztet emberi receptorokon, illetve enzimeken állítják be, hiszen humán gyógyszert akarunk forgalomba hozni. Ugyanakkor elengedhetetlen, hogy vegyületeinket valamely farmakológiában használatos állatfaj (pl. egér, patkány, tengerimalac stb.) hasonló (ortológ) receptorán, illetve enzimjén is megvizsgáljuk, hiszen ez fontos adat lesz a vezérmolekula-optimálás során végzett in vivo farmakológiai és a toxikológiai vizsgálatokhoz. Az ortológ célponton végzett in vitro vizsgálatokat is célszerű több szinten (kötődés, funkcionális válasz, sejtes aktivitás) elvégezni.