Benedek Csilla, Hajas Lívia, Hermánné Dr. Juhász Réka

Élelmiszerkémiai laboratóriumi gyakorlatok

Dietetikus hallgatók számára

9. feladat: Az amiloglükozidáz enzim katalizáló hatásának vizsgálata a hőmérséklet függvényében

Készítsen hígított Lugol-oldatot (old. 1. lépés). Óvatosan elegyítse a szubsztrátot és az enzimet, majd az elegyet ossza öt felé (ld. 2–4. lépés). A kémcsöveket helyezze különböző hőmérsékletű helyekre (ld. 5. lépés). Az előírt időközönként vizsgálja meg a kémcsövekben a keményítő hidrolízisének állapotát (ld. 6–8. lépés). A tapasztalt színváltozások alapján becsülje meg az enzim hőmérsékletoptimumát.

Egy 100/150 ml-es főzőpohárba tegyen 50 ml desztillált vizet és adjon hozzá 1 csepp Lugol-oldatot. Üvegbottal keverje el. (Tegye félre, a 7. lépésig nem lesz rá szükség.)
Mérőhengerrel mérjen ki egy 50 ml-es főzőpohárba 30 ml 1%-os keményítő oldatot.
Adjon hozzá 300 μl AMG oldatot és óvatosan homogenizálja.
Vegyen öt kémcsövet, majd mindegyikbe pipettázzon 5-5 ml-t a keményítő-AMG oldatból.
Az első kémcsövet tegye jeges fürdőbe. A másodikat helyezze a 37 °C-os vízfürdőbe, míg a harmadikat a 60 °C-os vízfürdőbe. A negyediket tegye forró vízbe. Az utolsó kémcsövet hagyja az asztalon a kémcsőállványban. Ez lesz a szobahőmérsékletű minta.

Jegyezze fel a kezdési időt! …………………….

50 percen keresztül minden 10. percben vegyen ki a kémcsövekből kb. 15-15 cseppet üres műanyag csövekbe. A mintavételhez használjon Pasteur-pipettát.

A pipettát mintavétel után benne hagyhatja a kémcsőben, nem szükséges a mintavételek között elmosni. De arra figyeljen, hogy a pipettában maradt oldatot mindig engedje vissza a kémcsőbe, tehát a pipettát mindig „üres állapotban” hagyja ott a következő 10 percre.
A kivett mintarészletekhez adjon hígított Lugol-oldatot úgy, hogy a mintarészletet tartalmazó műanyag csövet a második jelzésig feltölti Lugol-oldattal. Óvatosan rázza össze és az alábbi táblázatba jegyezze fel a tapasztalt színváltozást (pl. sötétkék, sötétlila, halványlila, barna, barnássárga, sárga).

A műanyag csöveket nem muszáj megszámozni, ha a mintavételnél betartja az alábbi sorrendet:

Idő (perc)	jeges fürdő ~7 °C	szobahő ~20 °C	vízfürdő 37 °C	vízfürdő 60 °C	forró víz ~ 80 °C
10
20
30
40
50
60

Két mintavétel között mosogassa el a kémcsöveket!

Az utolsó jódpróba a 60. percben legyen. Ekkor már nem kell mintát venni. A kémcsöveket vegye ki a fürdőkből, és helyezze őket a kémcsőállványra. Itt is figyeljen a sorrendre! A kémcsövekben maradt oldathoz adja hozzá a Lugol-oldatot és jegyezze fel a tapasztalt színváltozást.

Beadandó:

Mennyi idő és milyen hőmérséklet szükséges az adott enzimkoncentráció mellett az 1%-os keményítőoldat elbontásához? Humán vagy mikrobiális eredetű enzimmel dolgozott? Válaszait röviden indokolja! A jegyzőkönyvben is szerepeljenek a megfigyelt színváltozások!

Felkészülést segítő kérdések

Milyen módon befolyásolják a kémiai reakciókat az enzimek?*
Milyen módokon lehet egy enzim aktivitását meghatározni?
Milyen tényezők befolyásolják az enzimek aktivitását? Soroljon fel legalább hármat!
Mi az aktív centrum?*
Mit nevezünk szubsztrátnak?*
Milyen átalakulást katalizál az amiloglükozidáz enzim?
Mi a keményítő?*
Mi az izocukor?*
Milyen monoszacharid nyerhető a keményítő hidrolízise során?
Mi a Lugol-oldat? Milyen céllal adja a keményítőhöz az enzimaktivitás vizsgálata során?
Milyen színű lesz a minta a Lugol-oldat hatására, ha még tartalmaz keményítőt?
Milyen színű lesz a minta a Lugol-oldat hatására, ha főleg dextrineket tartalmaz?
Milyen színű lesz a minta a Lugol-oldat hatására, ha elbomlott benne a keményítő?

A *-gal megjelölt kérdésekre a válasz a kurzus Moodle felületére feltöltött elméleti összefoglalóban található. A felkészülés során ezt az anyagot is nézze át!