Itt szeretnénk kitérni arra a jelenségre, hogy a gyógyszercégek házon belüli adatbázisai gyakran beszállítócégek „által” frissülnek. A cégen belüli szintetikus tevékenységen kívül (ami általában már egyébként is egy meglevő találat köré épül) a kémiai változatosság (diverzitás) növelését ugyanis a gyógyszercégek úgy oldják meg, hogy vegyülettárukat összehasonlítják a beszállító cégek kínálatával, majd olyan alapszerkezeteket választanak megrendelésre, amik a házon belüli vegyülettárban alulreprezentáltak vagy teljesen hiányoznak. Ennek következtében a házon belüli és a beszállítói adatbázisok között jelentős átfedések keletkezhetnek. A másik fontos következménye ennek a jelenségnek az, hogy a gyógyszercégek belső adatbázisai közötti átfedés is egyre nő, ami komoly versenyhátrányt jelenthet. Előfordulhat ugyanis, hogy több gyógyszercég azonosítja ugyanazt a kémiai kiindulópontot HTS-sel, melynek optimalizálása könnyen nagyon hasonló vegyületbe torkollhat, és ez iparjogvédelmi problémákhoz vezethet. Ez a probléma elvisz minket a VS egy újabb lehetséges szűrendő adatbázis típusához, a házon belüli kémiai tér fogalmához (in-house chemical space). A házon belüli kémiai tér egy olyan virtuális molekulakönyvtár, amely nem korlátozódik a „polcon levő” molekulákra, hanem nagyságrendekkel nagyobb annál, ezért jóval kisebb az esély arra, hogy a gyógyszercégek ugyanazt a szerkezetet azonosítsák kémiai kiindulópontként. Ezt a kémiai teret a rendelkezésre álló alapszerkezetek (scaffoldok), a rajtuk levő lehetséges továbbépítési pontok és szabályok, valamint a pontokhoz kapcsolható szubsztituensek építik fel. Az így elérhető kémiai tér nagyságát Weininger peldájával (Weininger, 1998) érzékeltethetjük: egy egyszerű n-hexán-molekula lehetséges szubsztitúcióinak száma 14 szubsztituálható pontot és 150 lehetséges szubsztituenst feltételezve elérheti a 1029-es nagyságrendet. Ennek a megközelítésnek az az előnye, hogy kifejezetten alkalmas VS-re, ugyanis nincs feltétlenül szükség az összes molekula akárcsak virtuális formában történő generálására (enumerálására). Megfelelő algoritmusokat alkalmazva a szűrést az egyes építőelemek szintjén, és nem a teljes molekulák szintjén végezhetjük. A kapcsolási szabályok általában olyan kémiai reakciókon alapulnak, amelyek rutinszerűen végrehajthatók, azonban az egyes esetek specificitása miatt ezen szintézisek sikerességi rátája változó. Ez az arány ugyanakkor nem sokkal marad el a beszállító cégektől rendelt és sikeresen megérkezett vegyületek arányától. A házon belüli kémiai tér koncepcióját követve egyes beszállító cégek is elkészítettek saját alapszerkezeteiken és szintézis-tudásbázisukon alapuló kémiai terüket, amelyet virtuális molekulakönyvtárak formájában (korábbi tapasztalatokon alapuló becsült szintetikus sikerrátával együtt) általában szintén az érdeklődők rendelkezésére bocsátanak. Jelenleg ezek szállítási sikerrátája még elmarad a „polcról elérhető” vegyületekétől, ugyanakkor hozzájuk képest nagyságrendekkel nagyobb kémiai teret biztosíthatnak a virtuális szűréshez (Kuan és mtsai, 2023).

A VS céljából elérhető kismolekulák számának robbanásszerű növekedése szükségessé tette olyan keminformatikai eszközök kifejlesztését, amelyek speciális molekulamegjelenítési módszerekkel, molekulaleírókkal (deszkriptorokkal) és metrikákkal képesek a molekulakönytárak hatékony kezelésére. A molekulákat legtöbbször gráfokként ábrázolják, amelyekben a gráfcsúcsok (csomópontok) atom(csoport)okat, míg a csúcsokat összekötő élek kötéseket jelölnek. A gráfábrázolás egyik előnye, hogy hatékony keresési/illesztési algoritmusokkal értékes információkat nyerhetünk ki belőlük. Az egyes csúcsokhoz rendelve tárolhatjuk az atomok különböző tulajdonságait, amelyeket aztán speciális deszkriptorokká alakíthatunk (lásd 4.6.1.2. fejezet). A molekularajzoló programokban is általában gráfokként ábrázoljuk a molekulákat, amiket aztán a hozzájuk kapcsolódó adatokkal együtt a számos, széles körben elterjedt molekula-fájlformátumok valamelyikében menthetünk el. Az, hogy milyen formában tároljuk a molekulát, alapvetően későbbi felhasználásuktól függ. A formátumok között lehetséges a konverzió (pl. OpenBabel programmal [Guha és mtsai, 2006]), azonban ennek során információvesztés előfordulhat (pl. MDL Mol-fájlból InChI-formátumba történő konverzió esetén a 3D szerkezet elvész). A VS-hez használt programok általában többféle inputformátumot tudnak kezelni, amelyeket az esetek többségében átalakítanak saját belső gráfreprezentációjukra, és ezzel dolgoznak tovább. Egy molekula adott tautomerének, protomerének, sztereomerének és konformerének tárolására alkalmas lehet az MDL Mol-formátum (Dalby és mtsai, 1992). Amennyiben a molekulához speciális információkat (pl. rendelkezésre álló mennyiség, ár stb.) is tárolni szeretnénk, használhatjuk az SDF- (structural data file) formátumot. Ugyanakkor az MDL Mol- és az SDF-formátumok hátránya, hogy belőlük az információ kinyerése bonyolult és sokáig tart. Ezért olyan feladatokra, amelyek nem igényelnek 3D szerkezetet vagy egyéb pluszinformációkat, egyszerűbb formátumok javasoltak. Az egyik széles körben elterjedt ilyen formátum, a SMILES (Weininger, 1988) a molekulát karakterláncként (string) írja le, amely megfelelő algoritmusokkal könnyen feldolgozható/alakítható. A SMILES-ban nincsenek 3D koordináták, ugyanakkor a speciális protomerek, tautomerek és sztereomerek tárolása lehetséges. Az InChI-formátum (http://www.iupac.org/inchi), amely a molekulákat tautomer és részlegesen protomer független módon ábrázolja, alkalmazható adatbázisok egyediesítésére, vagyis arra, hogy azonos molekula egynél többször ne fordulhasson elő az adatbázisban. Így például egy egyesített beszállítói adatbázis tesztelése során elkerülhető ugyanannak a molekulának a többszöri szűrése.

A VS szűrendő adatbázisának előkészítésénél – a HTS-hez hasonlóan – számos szempontot kell figyelembe vennünk. A legfontosabb lépéseket a következőkben foglaljuk össze:

Ezt követően célszerű eltávolítani az „egzotikus” atomtípusokat (pl. Hg, As, Pb, Si) tartalmazó molekulákat. Ez részben praktikus szempont, mivel ezekre az atomokra a VS-módszerek nagy részének nincsenek megfelelő paraméterei, másrészt eltávolításuk a várható toxicitás miatt is indokolt. Virtuális szűrésre általában azokat a molekulákat használjuk, amelyek az ún. „szerves alhalmazba”-ba (organic subset) tartozó nehéz atomokból (B, C, N, O, P, S, F, Cl, Br, I) épülnek fel.

Egyes esetekben a molekulaleíró fájlok csak nehéz atomokat tartalmaznak, és a hidrogéneket a vegyértékek és a kötésinformációk alapján implicit módon adják meg. Ilyenkor a szűrés típusától függően szükség lehet az explicit hidrogénatomok felhelyezésére.

A következő lépés az egyediesítés, amelyre például az InChI-formátum alkalmazható. Az InChI generálását érdemes a molekulák semleges formáján elvégezni (amennyiben létezik ilyen), így elkerülhetjük, hogy egy molekula különböző protonáltsági formáit külön tároljuk és szűrjük. Az egyediesítést követően elő kell állítanunk a molekulának azon protomer, illetve tautomer állapotait, amelyek a VS szempontjából relevánsak lehetnek. Ideális esetben csak azt a protomer és tautomer formát kellene előállítanunk, ami az adott célfehérje kötőhelyén domináns. A helyzetet nehezíti azonban, hogy protonálódási állandók csak korlátozott számban, tautomer egyensúlyi állandók pedig csak elvétve állnak rendelkezésünkre ahhoz, hogy megfelelő protomer/tautomer predikciós módszereket fejlesszünk. A feladatot tovább bonyolítja, hogy még ha ismernénk is az adott molekula protonálódási/tautomerizálódási állandóit vizes közegben, a kötőhelyen kialakuló kölcsönhatások és egyéb körülmények (pl. környezet dielektromos állandója) az egyensúlyokat jelentősen eltolhatják. A protomerek/tautomerek kérdése azért is kritikus, mert a különböző formák ellentétes jellegű (pl. H-akceptor helyett H-donor) kölcsönhatásokat alakíthatnak ki. Általában azt a protomert és tautomert igyekszünk generálni, amely a célzott makromolekula működésének pH-ján legnagyobb arányban fordul elő. Mivel azonban a predikció a fenti okok miatt pontatlan, nem ritka, hogy (pl. dokkoláshoz) egyszerre több lehetséges formát is előállítunk, és ezek közül a szűrések során legjobb eredményt adót vesszük figyelembe. A protomerek és tautomerek előállítása történhet ún. szabályalapú módszerekkel, ahol egy adott alszerkezetnek mindig ugyanazt a formáját állítjuk elő. Egy tipikus ilyen szabály lehet például minden tercier amin protonálása. Ugyanakkor előfordulhat, hogy az alszerkezet környezete jelentősen eltolja az adott protonálható csoport protonálódási állandóját, ezt azonban ezzel a módszerrel nem tudjuk figyelembe venni.

Ezt követően a VS szűrési rendszerünktől függően szükség lehet még a molekulát alkotó atomok töltéseinek számítására. Mivel a VS szűrendő adatbázisa általában nagyszámú molekulából áll, ezért számításigényes töltésszámítási módszereket csak ritkán alkalmazunk, ezzel szemben gyakori a formális töltések használata. Ilyenkor egész számú töltést rendelünk a megfelelő atomokhoz (pl. +1 töltést egy protonált tercier amin N-atomjához). A töltések ilyenfajta eloszlása ugyan távol áll a valóságtól, amikor az elektrontöbblet vagy -hiány több atomon oszlik szét, azonban egyes VS-programok jobban működnek formális töltésekkel, mert paramétereik erre lettek optimalizálva. A másik lehetőség a parciális töltések számítása, amikor az egyes atomokra eső számított töltést valós számokkal jelöljük.

A VS során gyakran alkalmazunk olyan módszereket, amelyek a molekulák alacsony energiájú (ideális esetben a kötőhelyen megvalósuló) konformációját igénylik (pl. molekulák térbeli illesztése vagy dokkolása a makromolekula szerkezetébe). A 3D koordináták számítása történhet a VS közben is (pl. az inkrementális dokkoló programok a kötőhelyen építik fel a ligandumot), azonban gyakori, hogy a lehetséges konformer(eke)t előre kell generálnunk. Az előállított konformerek száma függhet az alkalmazni kívánt VS-eljárástól. Az első konformergeneráló programok szabályalapú eljárást követtek (pl. CONCORD [Tripos LP., St. Louis, MO, USA]). Egyes módszerek az általános szabályokat energiaminimalizálással kombinálták és szolvatációs modelleket is felhasználtak (pl. Omega [OpenEye Scientific Software Inc., Santa Fe, NM, USA]). Kisszámú molekulára alaposabb konformációs analízist is végezhetünk pl. tisztán erőtéralapú energiaminimalizálás és egy sztochasztikus mintavételező módszer (pl. Metropolis Monte Carlo) kombinációjával. Az energiaminimalizálást általában ún. molekuláris erőterekben végezzük. Ezek valójában molekulamechanikai energiatagokból és hozzájuk tartozó speciálisan illesztett paraméterekből álló egyenletek, melyek segítségével kiszámíthatjuk egy molekula adott állapotának energiáját. Amennyiben a molekula szabadsági fokait leíró paramétereket (pl. torziós szögek lehetséges értékei) egy adott molekulamechanikai erőtérben számolt energiájukkal együtt ábrázoljuk, a potenciális energiafelülethez (PEF) jutunk. Az energiaminimalizálás nem más, mint a PEF egy adott kezdőponthoz legközelebb eső lokális energiaminimumának megtalálása. A konformációs analízis a PEF bejárását és a globális energiaminimum megtalálását jelenti. A konformációs analízist végrehajthatjuk szisztematikus módon (a PEF-re adott felbontású rácsot illesztünk és a rácspontokból energiaminimalizálást indítunk) vagy sztochasztikus módszerrel. A sztochasztikus módszerek közé tartoznak például a Monte Carlo-eljárások, ahol a kiindulási szerkezeteket véletlenszerű mintavételezéssel választjuk ki. A Metropolis Monte Carlo-módszer esetében a véletlenszerűen generált kiindulási szerkezetet az energiaszintje alapján fogadjuk, vagy vetjük el. Hogyha az új kiindulási szerkezetnek alacsonyabb az energiaszintje, mint a korábbi optimalizált szerkezetnek, akkor megtartjuk (és energiaminimalizálást indíthatunk belőle). Ha magasabb, akkor sem feltétlenül vetjük el, hanem véletlenszám-generálással a Boltzmann-valószínűség számításával az energiakülönbséget is figyelembe véve döntünk.

A ligandumok konformer generálásánál fontos kérdés, hogy hány és a globális minimumhoz képest az adott számolási módszer mellett mekkora energiatöbblettel rendelkező konformert használjunk fel a VS-hez. Itt több szempontot is érdemes figyelembe venni. Egyrészt a ligandumra és a fehérjére egyaránt igaz, hogy a kötődés során felléphet az ún. indukált illeszkedés (induced fit) effektusa, vagyis a ligandum a kötődés előtti állapothoz képest jelentős konformációváltozáson megy keresztül. Másrészt a konformerek generálására alkalmazott módszereink meglehetősen pontatlanok. Ezek alapján észszerűnek tűnhet minél több konformer előállítása és tesztelése, ezáltal a hamis negatívak számának csökkentése. Ezzel ellentétes szempont viszont a megnövekedett számításigény mellett az is, hogy az indukált illeszkedés nem feltétlenül kedvező egy tervezett ligandum szempontjából. A valóságban ugyanis egy ligandum affinitását egy adott makromolekulához a szabad (nem kötött) ligandumkonformerek előfordulási aránya és a hozzájuk tartozó affinitások szorzatösszege adja (Sharp és mtsai, 2005):

 

Ez azt jelenti, hogy amennyiben a szabad formában a kötőkonformáció csak kis arányban van jelen, akkor hiába a kötőkonformer nagy affinitása, a molekula egészének affinitása ennek csak töredéke lesz. A nagy energiájú konformerek megtartása tehát növelheti a hamis pozitívok arányát. Hogy ezt elkerüljük, az egyes konformerekkel együtt érdemes tárolni azt az információt, hogy a globális minimumhoz képest mennyire magas az energiájuk, és ezt figyelembe venni a VS utáni rangsorolásnál (lásd 4.6.4.4. fejezet).

Az sp3 típusú sztereocentrumok kiralitása általában egyértelműen meghatározott a kismolekulák esetében, ennek hiányában azonban a konformergenerálás során minden lehetséges sztereomert figyelembe kellene vennünk. A lehetséges sztereomerek száma azonban az ismeretlen kiralitású centrumok számával exponenciálisan növekszik, ezért a sztereomerek számát általában maximalizálni szoktuk. Mivel a cisz-transz izomerekhez általában kisebb energiagát tartozik, ezért ezek a formák egymásba könnyebben átalakulhatnak. Ennek megfelelően, cisz-transz izomériára vonatkozó adat a kismolekulákhoz ritkán áll rendelkezésre, ezért a konformergeneráláskor általában az adott módszerrel legkisebb energiájúnak adódó formát vesszük figyelembe. A konformerekhez hasonlóan a sztereomerek szűrés előtti enumerálásától is el lehet tekinteni akkor, hogy ha erre a szűrés során kerül sor, illetve ha az alkalmazott VS módszer nem sztereokémia-függő.

A következőkben olyan opcionális előkészítési lépéseket mutatunk be, amelyek már előszűrési lépéseknek is tekinthetők. Az előszűrések célja általában az, hogy a VS során azonosított találatok minél jobb eséllyel vágjanak neki a vezérmolekula-optimalizálási folyamatnak. Főként olyan előszűrők alkalmazásáról van tehát szó, amelyek vezérmolekula-optimalizálási tapasztalatokra épülnek, és szűrik azokat a molekulákat, amelyek esetleges nagy affinitásuk ellenére (általában farmakokinetikai okokból) mégsem alkalmasak a továbbfejlesztésre. Ezek a racionális megfontolások csökkenthetik a gyógyszerkutatás későbbi fázisainak költségeit azzal, hogy csak megfelelő minőségű (pl. kedvező farmakokinetikai tulajdonságokkal rendelkező), kevesebb optimalizálást igénylő találatokat engednek tovább. Érdemes tehát ezeket a szűrőket a gyógyszerkutatás minél korábbi szakaszában alkalmazni. A vezérmolekula-szerűség és gyógyszerszerűség becslésére épülő szűrők tehát a gyógyszerkutatás későbbi fázisaiból származó tapasztalatokra, így például az azonosított vezérmolekulák, illetve a bevezetett gyógyszermolekulák szerkezetére épülnek. Ezek a szűrők (pl. Lipinski ötös szabálya [Lipinski és mtsai, 1997] – rule-of-five, RO5, Rees hármas szabálya [Rees és mtsai, 2004] – rule-of-three, RO3) olyan egyszerűen számítható molekulaleírókra épülnek, mint például az MW, a logP, a PSA, a HBA, a HBD, a rotálható kötések száma. A rotálható kötések számát több okból is érdemes alacsonyan tartani. A sok rotálható kötéssel rendelkező molekulák kötődése egyrészt nagy entrópiaveszteséggel jár, ezért várhatóan ezek a molekulák merev társaikhoz képest kisebb affinitásúak. Emellett azt is meg kell említeni, hogy a VS hatékonysága rohamosan csökken a rotálható kötések számának növekedésével. A fenti szűrők alkalmazásával tehát alapvetően a kisebb, kevésbé komplex vegyületeket engedjük tovább, aminek a VS eredményessége szempontjából egyaránt vannak előnyei és hátrányai is. A molekulák komplexitásának csökkenése általában gyorsítja a molekulaleírók számítását, a lehetőségek számának csökkenése miatt a molekulák térbeli illesztését és a makromolekulába történő dokkoláskor a kötőkonformációk számítását. Másrészről viszont, a túl kevés kölcsönhatási pont nehezítheti a kritikus kölcsönhatások azonosítását egy adott kötőhelyen.

Az instabil/reaktív csoportot tartalmazó molekulák eltávolítása szintén fontos, mert bár ezek a csoportok gyakran kerülnek a szűrési listák élére (éppen a reaktív csoportok erős kölcsönhatásainak köszönhetően), specificitásuk alacsony, és ezért a célmakromolekulán kívül általában több fehérjéhez is – akár kovalens kötéssel – kötődnek, amely mellékhatásokhoz vezethet. Kovalens gátlószerek tervezésekor viszont alapfeltétel a reaktív csoport jelenléte a molekulában, mely esetben a molekula egyéb részei kell, hogy biztosítsák a szelektivitást. A reaktív csoportokkal részben átfedést mutat az ún. gyakori találatok (frequent hitter) és az aspecifikus (időfüggő és koncentrációfüggetlen) kötődést mutató molekulák (promiscuous binder) csoportja. Ezeket a HTS-ekben is tipikusan megjelenő hamis pozitív molekulákat specifikus alszerkezetekre történő keresésekkel részben kiszűrhetjük. Erre szolgál pédául egy 180 alszerkezetből álló, aspecifikusan kötődő és reaktív csoportokat tartalmazó szűrőrendszer, amely a vizsgált molekulákra aspecificitási indexet (Promiscuity Ratio Index, PRI) számol (Pearce és mtsai, 2006). A PRI-paraméter 1 feletti értéke egy adott alszerkezet esetében az átlagosnál magasabb találati valószínűségre utal. Emellett gyakran alkalmazzák, az ún. PAINS-szűrőket is, amely a biológiai szűrővizsgálatok tipikus hamis pozitív molekuláit hivatott kiszűrni (Baell és mtsa, 2010). A BMS és a Lilly gyógyszercégek kutatói ugyancsak közzétettek hasonló célú, nemkívánatos alszerkezetekre és fizikokémiai paraméter tartományokra vonatkozó szűrési szabályokat (Pearce és mtsai, 2006; Bruns és mtsa, 2012). Itt szeretnénk említést tenni az ún. kitüntetett szerkezetek (privileged structures) fogalmáról (Evans és mtsai, 1988). A kitüntetett szerkezetek gyakran mutatnak nagy affinitást egymástól távoli (kis szekvenciaazonosságot mutató) célfehérjéken. Evans elmélete szerint ezek a szerkezetek nagyobb eséllyel mutatnak aktivitást, de optimalizálásuk során gyakran szelektivitási problémákba ütközünk. Jelenlegi tapasztalataink alapján azt mondhatjuk, hogy a kitüntetett szerkezetek szelektivitási problémái inkább ezen struktúrák mellőzése mellett szólnak. Egy másik gyakori eset a szűrendő adatbázis előkészítésénél, hogy egy adott alszerkezettől el akarunk távolodni (pl. iparjogvédelmi okok miatt). Ilyenkor a problémás alszerkezetekre való szűréssel eltávolíthatjuk a számunkra érdektelen molekulákat.

Az előszűrési lépések között feltétlenül említést érdemelnek a farmakokinetikai vagy ADME(T) virtuális szűrési megoldások, melyekről a 4.6.6 fejezetben lesz részletesebben szó.

A VS-adatbázis előkészítő lépései közé sorolhatók még a találati arány növelését célzó ún. fókuszált könyvtárak (focused library). Egy fehérjecsaládra (pl. G-protein-kapcsolt receptorok, kinázok) specifikus szűrendő könyvtár létrehozása alapulhat specifikus alszerkezeteken (pl. a RECAP- (Retrosynthetic Combinatorial Analysis Procedure) eljárással (Lewell és mtsai, 1998)) vagy megfelelő fizikokémiai paramétereken, amelyek jellemzőek az adott makromolekulacsalád ligandumjaira.

Végül, de egyáltalán nem utolsósorban nagyon fontos szempont a VS-adatbázis kémiai változatossága, azaz diverzitása. Egymáshoz nagyon hasonló molekulák szűrése ugyan jelentheti azt, hogy egy adott szerkezeti körből nem csak egy, hanem számos találatot tudunk azonosítani a szűrés végén, azonban a vezérmolekula azonosításának szakaszában hasznosabb lehet több különböző szerkezeti kör néhány elemének a vizsgálata. Emiatt célszerű (akárcsak a HTS-sel) a szűrendő adatbázis összeállításakor maximális diverzitásra törekedni – az egyes szerkezeti családokból csupán néhány reprezentánst választani. A szűrendő adatbázis diverzitásának növelése azért is fontos szempont, mert a házon belüli, a beszállítói és a kombinatorikus módszerekkel készített könyvtárakra egyaránt jellemző, hogy hasonló alapszerkezetek hasonló szubsztituensekkel módosított változatait tartalmazzák. A molekulák közötti hasonlóság/diverzitás meghatározására gyakran az ún. molekuláris ujjlenyomatokat használják (lásd 4.6.1.2. fejezet).