A vegyületek célpontokhoz való affinitásának becslése a kémiai kiindulópont-keresés lényeges eleme lehet, ez a becslés azonban tipikusan számításhatékony pontozófüggvény alkalmazására korlátozódik (lásd 4.6.2.3 fejezet). Az optimalizálás során azonban ezek pontosságát lényegesen meghaladó, molekuladinamikán alapuló kötődési szabadentalpia-számítást alkalmazhatunk, amelynek főbb elemeit alább tárgyaljuk. Bemutatjuk a QSAR-vizsgálatokat, amelyek prediktív modellt építenek a vegyületek tulajdonságai és biológiai hatása között, továbbá a de novo gyógyszertervezés elemeit; ez a módszer egyszerre tűzheti ki célul a kémiai kiindulópont azonosítását és annak optimalizálását. Az optimalizálás további sajátsága az ADME-T-tulajdonságok igényes becslése. Bár a fizikai kémiai és ADME-T-tulajdonságok megjelennek a kutatás korábbi fázisában is, ilyen például a Lipinski-szabályok alkalmazása vegyülettárak összeállításában (lásd 4.6.4.1 fejezet), az optimalizálás előrehaladtával pontosabb, a vegyületcsaládra specifikus modellek építhetők.

A módszereiben szerteágazó QSAR-eljárások közös jellemzője, hogy matematikai összefüggést keresnek a vegyületek leírói és valamely tulajdonságuk, például a biológiai aktivitásuk között. A céltulajdonság változatos sajátság lehet, így például jellemezheti a terápiás célponttól eltérő fehérje iránti affinitást, a toxicitást vagy a metabolikus stabilitást. Hangsúlyozandó, hogy a QSAR-módszer alkalmazása feltételezi, hogy a vegyületek egy csoportjáról rendelkezünk adatokkal, vagyis néhány vegyület céltulajdonsága ismert.

A céltulajdonság, amely a biológiai aktivitáshoz kapcsolódik, lehet folytonos változó, például IC50, vagy Ki érték, és vehet fel diszkrét értékeket. Utóbbi esetre példa, amikor a vegyületeket aktivitásuk szerint kategorizáljuk (pl. aktív és inaktív), és a kategóriákhoz számokat rendelünk, például 0-t és 1-et. A kategorizálás lehet finomabb is, amikor az előbbiek mellett megkülönböztetünk gyengén aktív vegyületeket is. A céltulajdonság típusa (folytonos vagy diszkrét) meghatározza a leírók választását és a matematikai összefüggés célszerű keresési formáját is.

A vegyületek leíróit a 4.6.1.2 fejezet tárgyalja. Az optimalizálás során olyan leírókat is alkalmazhatunk, amelyek mérése vagy számítása munka- és erőforrás-igényes, tekintettel arra, hogy általában kisebb számú vegyülettel dolgozunk, mint a kémiai kiindulópont keresésekor. Ilyenek például a molekulák 3 dimenziós szerkezetéből számítható dipólus momentum vagy az oldószer által hozzáférhető felület (SASA = solvent accessible surface area). Esetenként kvantumkémiai leírókat is alkalmazunk, mint amilyen például a HOMO- (highest occupied molecular orbital) energia. A 3 dimenziós QSAR-módszerek (Verma és mtsai, 2010) különböző terek (pl. elektrosztatikus vagy van der Waals) rácspontokban számított értékeit alkalmazzák leírókként. A felsoroltak csak érzékeltetni kívánják a lehetséges leírók sokszínűségét és nem törekednek teljességre.

A nagyszámú leíróból a modellépítésre leginkább alkalmasak kiválasztását és a modell építését változatos matematikai eszközök segítik. A regressziós modellek közül a többszörös lineáris regresszió vagy a részleges legkisebb négyzetek módszere lináris modellek felállítására alkalmasak, míg mások, így például a mesterséges neurális hálózatok (ANN = Artificial Neural Networks) vagy a „support vector machines” eljárás nemlináris modellekre is. A változókiválasztás történhet külön lépésben, például főkomponens-analízissel, vagy gyakrabban a modellépítéssel egyidejűleg. Utóbbi esetben eredményes lehet sztochasztikus keresési módszerek, például a genetikus algoritmus (GA = Genetic Algorithm) vagy az általánosított szimulált hőkezelés (generalized simulated annealing) és a korrelációs módszerek együttes alkalmazása.

Egyes módszerek magukban hordozzák vagy legalábbis korlátozzák a lehetséges változókat. Így a 3D QSAR-leírói molekuláris terek, és az analízis nehézsége többnyire nem a változók kiválasztásában, hanem a molekulák egymásra illesztésében rejlik. Ezzel szemben a 2D módszerek nagyszámú molekula és nagyszámú leíró egyidejű kezelésére alkalmasak, és az analízis jól automatizálható. Ugyanakkor az alkalmazás során a pusztán matematikai megfontolások mellett célszerű az értelmezhetőséget is szem előtt tartani, vagyis előnyben részesíteni azokat a paramétereket és összefüggéseket, amelyek észszerűen magyarázzák a szerkezet és a biológiai hatás közötti kapcsolatot.

A biológiai hatás jellemzésére az IC50 vagy Ki logaritmusát, illetve leggyakrabban ezek ellentettjét, a pIC50 = –log(IC50), vagy pKi = –log(Ki) értékeket használjuk. Ennek oka az a feltételezés, hogy a QSAR-leírók a kölcsönhatáshoz tartozó energia típusú mennyiséggel állnak könnyen kifejezhető, legtöbbször lineáris kapcsolatban (vö. a ΔGbind kötődési szabadentalpia és a

search

ligandum–fehérje komplex disszociációs egyensúlyi állandó közötti ΔGbind = RTlogKd összefüggéssel).

A modell építését feltétlenül követnie kell a modell validálásának. Ennek célja az, hogy megbecsüljük modellünk előre jelző képességét. A validálás fontossága nyilvánvaló, ha figyelembe vesszük, hogy egy QSAR-analízis legtöbbször új vegyületek tervezésének részét képezi. Ehhez a QSAR-modell a leírók és a célhatás közötti kapcsolat megértésének elősegítésével és a tervezett vegyületek biológiai aktivitásának előrejelzésével járul hozzá. A modell validálásának nehézsége részben onnan származik, hogy a QSAR-analízist a kutatás minél korábbi fázisában, viszonylag kisszámú adat birtokában igyekszünk elvégezni, majd a modellt minél szélesebb körben szeretnénk előrejelzésre használni. Egy modell minőségének jellemzője végső soron az, hogy az új vegyületek tulajdonságait milyen pontosan tudja előre jelezni, ezt azonban a modell felállításakor szeretnénk megbecsülni. A validálás különböző módszerei közül célszerű lehet többet is alkalmazni.

A QSAR-modellek prediktivitásmérésérnek egyik módja, hogy a modell építése előtt az ismert aktivitású molekulákat tanító és ellenőrző halmazra bontjuk. A tanító halmaz molekuláival épített modellt az ellenőrző halmazra számított aktivitás többféle módon mért jóságának mértékével validáljuk. A molekulák tanító és ellenőrző halmazra való alkalmas szétválasztása kritikus eleme a modell megfelelő validálásának. A tanító halmaz molekuláris tulajdonságainak el kell oszlania a tulajdonságok teljes terében, és a tanító és ellenőrző halmazban lévő molekulák tulajdonságainak egymáshoz közel kell lenni. Ezen elvek megvalósítására különböző módszerek ismertek (lásd például Golbraikh és mtsai, 2003).

A QSAR-modellek prediktivitásának mérésére gyakran alkalmazzák az egyelem-kihagyásos (LOO = leave-one-out) keresztellenőrzést. Ennek alapötlete, hogy a molekulák közül egyet elhagyva, a többire illesztetett egyenlettel számítják az elhagyott molekula tulajdonságát, és ezt az eljárást valamennyi molekulára elvégzik. Az így kapott számított és kísérleti értékek eltérése jellemzi a modell jóságát.

Egy másik, gyakran alkalmazott ellenőrzés, az Y-randomizáció (Rücker és mtsai, 2007); ekkor a modellépítést többször, véletlenszerűen összekevert célhatással ismételjük meg. Amennyiben ilyenkor is viszonylag jó statisztikai paramétereket (R2, q2) kapunk, az arra utal, hogy az adatkészletünk nem alkalmas megfelelő QSAR-modell felállítására.

A QSAR-modell lehetőséget nyújt új vegyületek tulajdonságainak előre jelzésére. Ehhez fontos tudatában lennünk, hogy a QSAR-modellek a vegyületek egy körére érvényesek, és előrejelzésre való alkalmazásuk csak ebben a körben indokolt. Egy vegyület aktivitásának megbízható előrejelzését akkor várhatjuk egy QSAR-modelltől, ha a kérdéses molekula hasonló a modell felállításához használt molekulákhoz. Az alkalmazhatósági tartomány célszerű meghatározása a modell jellemző paraméterei, tipikusan a QSAR-modell leírói (deszkriptorai) segítségével történhet. Másképpen fogalmazva azt mondhatjuk, hogy a megbízható előrejelzés olyan vegyületekre várható, amelyek leírói nem esnek távol a modell felállításához használt vegyületekétől.

Az in situ de novo tervezés során a vegyületet a fehérjéhez kötött állapotában módosítjuk, szemben az olyan vegyülettár tervezéssel, amikor előbb létrehozzuk a vegyületeket, majd azokat dokkolva választjuk ki az alkalmasakat. Az in situ tervezés történhet úgy, hogy először fragmenseket helyezünk a kötőzsebbe, majd ezekhez keresünk alkalmas összekötő elemeket. Alternatív eljárásként egyetlen fragmensből indulunk ki, és azt növeljük. Mindezek elvégzésére automatikus algoritmusok állnak rendelkezésre, amelyek paramétereit a felhasználó állíthatja be.

A de novo tervezés kritikus elemei magukba foglalják a felépített ligandum kémiai megvalósíthatóságának elemzését, és a kötődési affinitás megfelelő minőségű becslését. A de novo tervezés lényeges sajátsága, hogy a javasolt vegyületek tipikusan nem hozzáférhetők, és a szintetizálásukhoz szükséges befektetés csak a tervezés kellő hatásfoka esetén indokolt. Ez fokozott elvárásokat támaszt a tervezés megbízhatóságával szemben, amely nagyobb sikerrel elégíthető ki kísérletileg igazolt kötődésű vegyületek módosításával, mint teljesen új szerkezetek tervezésével. Megjegyzésre érdemes, hogy egyes de novo tervezőeljárások nemcsak a receptor szerkezetének ismeretében, hanem az aktív ligandumok tulajdonságaiból kiindulva is építhetnek új molekulákat; a tervezést vezérelheti egy aktív molekula alakja vagy farmakofór-modell is. Szükséges megemlíteni, hogy mivel egy de novo tervezett molekula lényegesen eltérhet az esetlegesen már ismert ligandumoktól, így a de novo tervezés nemcsak az optimalizálást támogathatja, hanem lehetővé teszi vezérmolekulák azonosítását is.

A de novo tervezés új iránya a generatív mesterségesintelligencia-modellek alkalmazása (Tang és mtsai, 2024). A nagyszámú bioaktivitás, fehérjeszerkezet, valamint a gyógyszerjelöltek további tulajdonságait meghatározó, például toxicitási adat lehetővé teszi modellek építését, amelyekkel új, kívánt tulajdonságú molekulák generálhatók vagy meglévők módosíthatók. Az eljárások alkalmasak lehetnek az alapváz módosítására, a vázra építendő új szubsztituensek tervezésére vagy teljesen új, diverz molekulahalmaz generálására, amely a molekulák szintetikus megvalósíthatóságát is figyelembe veszik.

A bélből való felszívódás in vitro modelljei a Caco-2 sejteken vagy a PAMPA mesterséges lipid kettős rétegen való permeabilitás. Ezek számítására az egyik legáltalánosabban használt leíró a poláris felszín (PSA), amely a molekula N- és O-atomjainak, valamint az ezekhez kapcsolódó H-atomoknak a van der Waals-felületét adja meg. Bár a PSA konformációfüggő, gyakran a molekula szerkezeti képletéből előállítható, funkciós csoportokhoz rendelt PSA-járulékok összegeként közelítjük a PSA-t, és a kapott TPSA („topological PSA”) nagy számú vegyületre jól korrelál a PSA-val (Ertl és mtsai, 2000). További, gyakran használt leírók a víz–oktanol megoszlási hányados (logP), valamint a különböző protonált állapotokat is figyelemebe vevő, pH-függő megoszlási hányados, a logD. A megoszlási hányados függvényében a permeabilitás tipikusan maximumot mutat, vagyis mind a túl apoláris (magas logP és logD), mind a túl poláris (alacsony logP és logD) vegyületek kedvezőtlen felszívódást mutatnak. Megjegyzendő, hogy a tapasztalat szerint az optimális megoszlási hányados függ a molekulatömegtől (MW), amely utóbbi maga is befolyásolja az ADME-tulajdonságokat. További gyakran használt leírók, amelyek összefüggést mutatnak a felszívódással, a hidrogénhídkötés kialakításának képessége, ahol megkülönböztetjük a H-kötés-donorok (HBD) és a H-kötés-akceptorok (HBA) számát. A molekulák flexibilitása, amelynek célszerű jellemzője azon kötése száma, amelyek körül szabad forgás valósul meg, szintén gyakran alkalmazott paraméter; a nagy flexibilitás kedvezőtlenül hat az ADME-tulajdonságokra. Fontos megjegyezni, hogy a tárgyalt leírók egyrészt általában több ADME-tulajdonságot is befolyásolnak, másrészt nem tekinthetők független paramétereknek. A Lipinski-szabályok (Lipinski és mtsai, 1997), amelyek az ADME-tulajdonságok által meghatározott biohasznosulást hivatottak jellemezni, kimondják, hogy orális gyógyszereknél jó biohasznosulás akkor érhető el, ha a logP ≤ 5, HBD ≤ 5, HBA ≤ 10 és MW ≤ 500 kritériumok közül egynél több nem sérül. Ezek a leírók gyorsan számíthatók, így nagyszámú molekulára hatékonyan előállíthatók és virtuális szűrésre összeállított vegyülettárak előszűrésére alkalmazhatók.

A központi idegrendszerre ható gyógyszerek fontos jellemzője a vér-agy gáton (BBB blood-brain barrier) való átjutás képessége, illetve ez ellenkező előjellel fontos lehet olyan vegyületek esetében, amelyeknél el akarjuk kerülni a központi idegrendszeri hatást. A BBB-penetráció előre jelzése hasonló típusú probléma, mint a felszívódás számítása, azzal a lényeges különbséggel, hogy egyrészt általában a leírók szűkebb tartományában valósul meg a penetráció (Lipinski és mtsai, 1997), másrészt kevesebb kísérleti adattal rendelkezünk, ami nehezíti a megbízható modellek építését.

A transzporterek is befolyásolhatják egyes molekulák sejtmembránon való átjutását. A P-glikoprotein (P-gp) az egyik legfontosabb, a sejt idegen anyagokkal szembeni védekezését segítő transzporter, így nagy jelentőségű annak előrejelzése, hogy egy vegyület P-gp-szubsztrát, vagy -inhibitor. A vizsgálatok egyrészt nagyszámú molekulaleíró segítségével igyekeznek modellt építeni a P-gp-szubsztrátok és nem szubsztrátok elkülönítésére (lásd pl. Cianchetta és mtsai, 2005; Gombar és mtsai, 2004), másrészt emlős P-gp-szerkezetek kötőhelyének ismeretében próbálják a kötődést modellezni. A kötőhely nagy mérete és aromás aminosav-oldalláncai összhangban vannak azzal, hogy a P-gp változatos szerkezetű molekulákat képes kötni, és egyúttal jelzik a modellezés nehézségét.

A metabolizmus előrejelzése is alkalmaz mind ligandum-, mind szerkezetalapú eljárásokat. A molekulák logP vagy logD értékkel jellemzett lipofilitásának növekedése a metabolikus stabilitás csökkenése irányában hat, de ennek mértéke molekulacsalád-függő. Mint fentebb tárgyaltuk, a lipofilitás a permeabilitást is lényegesen befolyásolja, ami jelzi optimalizálásának fontosságát és nehézségét, hiszen olyan tartományt kell találni a lipofilitásra, amely mind a megfelelő permeabilitást, mind a metabolikus stabilitást biztosítja. A metabolikus lebontás egyik kulcs enzimcsaládja a citokróm P450 (CyP450). Az enzimcsaládra jellemző a nagy, plasztikus és apoláris kötőzseb, összhangban azzal, hogy szerepe változatos szerkezetű xenobiotikumok oxidálása. A CyP450 enzimekkel való kölcsönhatás jellemzése magába foglalja a kötődés és az oxidáció kémiai folyamatának leírását. Míg az előbbi nem kovalens molekuláris felismerési jelenség, utóbbi kvantumkémiai módszerekkel számítható reaktivitással jellemezhető. Ilyen módon dokkolással és kvantumkémiai számítással a metabolikus átalakulás helye és valószínűsége modellezhető (metasite) figyelembe véve, hogy számos CyP450 izoenzim kísérleti szerkezete hozzáférhető. A CyP450 enzimek indukciója is becsülhető molekulák nukleáris receptorokkal – úgymint aril-hidrokarbon-receptorral (AhR), konstitutív androsztán eceptorral (CAR) és pregnán X-receptorral (PXR) – való kölcsönhatást vizsgálva. A szerkezetalapú modellek mellett változatos molekulaleírók és technikák, közöttük 2D és 3D QSAR-t, valamint gépi tanulást alkalmazó eljárások is ismertek a CyP450 enzimek szubsztrátjainak, inhibitorainak és induktorainak modellezésére (Kato, 2020; Rudik és mtsai, 2022; Tyzack és mtsa, 2019).

A toxicitás szerteágazó mechanizmusának (pl. genotoxicitás, immunotoxicitás, karcinogenitás) megfelelően az előrejelzésére alkalmazott in silico módszerek is változatosak és jelen vannak mind a kémiai kiindulópont keresésénél, mind az optimalizálásnál. A potenciálisan toxikus vegyületek azonosítását többféle végpontot figyelembe véve szakértői rendszerek támogatják (pl. DEREK (Marchant és mtsai, 2008), továbbá nagyszámú gépi tanulásos modellt dolgoztak ki (Tran és mtsai, 2023). Specifikus célpontokon való hatás modellezésére is rendelkezésre állnak QSAR-, szerkezetalapú és gépi tanulásos modelleket alkalmazó eljárások. Ezen célpontok közül a korábban tárgyalt CyP450 enzimek mellett említést érdemel a kardiotoxicitást eredményező hERG; a amellyel való kölcsönhatást hatékonyan előre tudjuk jelezni és tervezéssel elkerülni (Garrido és mtsai, 2020; Hanser és mtsai, 2019).