A pKa érték meghatározására a legelterjedtebb módszer a potenciometriás titrálás. Direkt potenciometria esetében a vizsgálandó vegyületet, sav/bázis karakterének megfelelően, erős savval vagy bázissal titrálják. A vegyület, illetve a mérendő funkciós csoport pKa értéke a titrálási görbe inflexiós pontja alapján adható meg. A módszer hátránya, hogy a vegyületből viszonylag nagy mennyiségű minta szükséges (~20–50 mg). Indirekt vagy különbségi potenciometria esetében az erős sav–erős bázis titrálást (pl. HCl és KOH) a mérendő vegyület nélkül, majd annak jelenlétében végzik el. A két titrálási görbe különbségéből többszörös függvénytranszformációt követően adható meg az ún. Bjerrum-függvény (Avdeef, 1982), ami a különbségi adatokból származtatott egyenérték proton- (nH) mennyiségét ábrázolja a pH függvényében és praktikusan a Henderson–Hasselbalch-egyenletet követi. Így a függvény inflexiós pontja(i) adja(ák) meg a vegyület pKa értéké(ei)t (Kerns, 2003). A módszer előnye, hogy a vizsgálandó anyagból lényegesen kisebb mintamennyiség elegendő. Az igazi áttörést itt a mikroelektródák megjelenése jelentette. A kereskedelmi forgalomban elérhető mikro-pH-mérők akár pár száz mikroliter térfogatú oldatok esetén is megbízhatóan használhatók. Így a korábbi 6–10 mg mintaigény helyett akár 1-2 mg-nyi minta is elegendő a különbségi potenciometriai mérésekhez. A pKa érték meghatározására kidolgozott további módszerek alapja, hogy a vizsgálandó vegyület olyan (jellemzően molekuláris) sajátságát mérik, ami pH-függő módon változik. Ezek közül fontosabbak a spektrofotometria (alapja, hogy a vegyület ionizálható csoportjától maximum kétkötésnyi távolságra kromofór szerkezeti egység legyen jelen a molekulában) (Avdeef, 2003), a kromatográfia (visszatartás, retenciós idő) (Oumada, 2002), a kapilláris elektroforézis (vándorlási sebesség) (Cleveland, 1993), illetve az NMR-spektroszkópia (kémiai eltolódás) (Hagen, 1968). Ezekben az esetekben a pKa meghatározása során a vizsgált fizikai, fizikai kémiai paramétert a várt protondisszociációs készségnek megfelelő szűkebb vagy nagyobb pH-tartományú közegekben mérik, illetve titrálják. A vizsgált paraméter változása a pH függvényében, hasonlóan a különbségi potenciometriához, szolgáltatja a Bjerrum-függvényt, melynek segítségével a fentiek szerint meghatározható(k) a pKa érték(ek). Az utóbbi módszerek érzékenysége általában egy-két nagyságrenddel nagyobb, mint a potenciometriás titrálásé. Így például az UV–pH titrálás akár 1 mg alatti mintaigénye, illetve egyszerű integrálása a 96 lyukú mérőlemez-, plate-olvasó rendszerhez biztosíthatja a nagy áteresztőképességű pKa-mérés lehetőségét is.

 

A direkt eljárások közül klasszikusnak tekinthető az egyensúlyi rázási (shake-flask) módszer. A technika hátrányát jelenti, hogy a termosztálás nehezen megoldható, a relatíve nagy mérési térfogat, illetve a fokozottan lipofil, vízben rosszul oldódó vegyületek mérése korlátozottan oldható meg. Jelenleg a legszélesebb körben elfogadott technika ebben az esetben is a már pKa-mérési eljárásoknál bemutatott indirekt potenciometria. A módszer elve, hogy a mérendő vegyületet először vizes, majd n-oktanol–víz rendszerben titráljuk. A megoszlási hányados a két titrálásból származtatott Bjerrum-függvény különbségéből határozható meg (Avdeef, 2003). A módszer előnye, hogy a két potenciometriás mérésből megadható a vegyület teljes logD–pH profilja. Hátránya, hogy alkalmazhatóságát ebben az esetben is korlátozza a vizsgált vegyület lipofilitása és az áteresztőképesség még az automatizált titrátorok esetében is csak a közepes szintet éri el. A nagyszámú vegyület lipofilitásának meghatározására irányuló törekvések eredményeképpen megjelentek olyan indirekt módszerek, amelyek pontosságukban ugyan elmaradnak, de robusztusságban és áteresztőképességben jelentősen felülmúlják a fenti két módszert. Az ezt kielégítő, általánosan alkalmazott kromatográfiás módszerek elvi alapja az, hogy a vegyületek fordított fázisú álló fázisokban mérhető visszatartása vagy retenciójának mértéke (logk’–RR-HPLC, RM–VRK) függ a lipofilitási sajátságuktól (Liang, 2015; Komsta, 2014). Ennek megfelelően a szerkezetileg hasonló vegyületek fentiek szerint mért lipofilitási adatainak felhasználásával előálló kalibrációs egyenes (pl. logk’–logP /logDpH) segítségével a vizsgálandó vegyület lipofilitása jó közelítéssel becsülhető. A módszer áteresztőképessége tovább növelhető azzal (főként a HPLC-módszer esetében), ha tervezetten összekevert vegyületek keverékmintáit (koktél) vizsgáljuk egy kromatográfiás futtatásban. További kromatográfiás eljárások a lipofilitás jellemzésére a mikroemulziós elektrokinetikus (MEEKC) (Poole, 2000) és a BMC- (biopartitioning micellar chromatography) (Escuder-Gilabert, 2004) módszerek. Az utóbbi két rendszerben a vizsgált anyag lipofil sajátságának megfelelően oszlik meg a micellák és a tompító oldat között, amit szintén a kromatográfiás visszatartás (retenció) jellemez.

 

Gyógyszerkémiai szempontból a hatóanyagok belső sajátságainak vizsgálatára, a szerkezet–vízoldhatósági összefüggések feltárására és a szerkezetoptimalizálási stratégia támogatására két alapmódszert, megközelítést alkalmaznak. A termodinamikai vagy egyensúlyi oldhatóság meghatározásának esetén a szilárd anyagot vizes (pufferelt) közegben, folyamatos anyagfelesleg biztosítása mellett, termosztált körülmények között (szobahőmérsékleten (r. t.) vagy 37 oC-on) rázatják állandóan a szilárd–folyadék rendszer egyensúlyának beálltáig (

search

24–48 óra). Az oldódási folyamat termodinamikailag meghatározó lépése az anyag kristályrácsának szétesése, tördelődése, illetve ezen részecskék nedvesedése, szolvatációja. Ennek köszönhetően, illetve a Noyes–Whitney- egyenletből is következően, a termodinamikai oldhatóság jelentős mértékben az anyag szilárd formájától (kristályos, amorf), illetve méretétől és méreteloszlásától függ. Az egyensúly beálltát követően a szilárd és vizes fázist elválasztják (ülepítés, szűrés, centrifugálás), majd a vegyület telített oldatának koncentrációját megfelelő analitikai módszerrel (elsődlegesen LC/UV, LC/MS) mérik. A termodinamikai oldhatóságot általánosan moláris vagy tömegkoncentrációban (n/V vagy m/V) adják meg. Másik általánosan és főként a gyógyszerkutatás korai fázisában alkalmazott módszer a kinetikai oldhatóság meghatározása. Ebben az esetben a vizsgálandó vegyületből egy megfelelő szerves oldószer (az in vitro tesztekkel történő harmonizáció miatt főként DMSO) segítségével törzsoldatot készítenek, majd a törzsoldat meghatározott mennyiségét adják hozzá a vizes (pufferált) közeghez. Ennek megfelelően az anyag oldatban kialakuló vég- vagy célkoncentrációja (tipikusan 200–1000

search

M) maximalizálva van. A DMSO-val történő előoldásnak köszönhetően az anyag vízben történő feloldódásához már nem kell legyőzni a kristályrács-energiát, így a kinetikai oldhatóság nem függ a kiindulási anyag szilárd formájától vagy annak egyéb fizikai sajátságától. Ezt követően az elegyet meghatározott ideig (2–4 óra) – biztosítva, hogy az oldódási kinetika a felfutó, lineáris szakaszán belül maradjon – kevertetik/rázatják. Az inkubálási idő letelte után az anyag fel nem oldott részét szűréssel/centrifugálással elválasztják az oldattól. A szűrlet koncentrációját megfelelő analitikai módszerrel (LC/UV, spektrofotometria, nefelometria, ma már ritkábban turbidimetria) határozzák meg. A kinetikai oldhatóságot jellemzően moláris koncentrációban adják meg, de fontos kiemelni, hogy ez alapvetően kinetikai, a vizsgálati protokoll szerinti időegységre vonatkozó adat. Tekintettel arra, hogy ebben az esetben egy könnyen automatizálható, tisztán oldatkezelésen nyugvó eljárással van dolgunk, a kinetikai oldhatóság mérését az iparban HTS-rendszerekbe integráltan, a felfedező kutatás korai időszakában végzik. A kapott kinetikai oldhatósági adatokat a vegyületek rangsorolására, szerkezeti optimalizálására, illetve a szintén DMSO-törzsoldatból kiinduló in vitro farmakológiai mérések tervezésére, monitorozására használják. Ezzel ellentétben a termodinamikai oldhatóság meghatározására időigényessége és a kiindulási kristályformára való érzékenysége miatt általában később, a fejlesztési szakaszban kerül sor. A termodinamikai oldhatóságot hagyományosan telítési rázótölcséres módszerrel határozzák meg (Yalkowsky, 1992). Az eljárás hátránya, hogy a mérés hosszú időt igényel, illetve a termosztálás nehezen oldható meg. Ennél lényegesen gyorsabb a módosított indirekt potenciometrián alapuló meghatározás. Az eljárás lényege, hogy a vegyületet erős sav–erős bázis jelenlétében titráljuk. A titrálás során a vegyületet először teljesen ionizált formába hozzuk, és amikor a pH közeledik a pKa értékéhez, a semleges forma megjelenésével az anyag elkezd kiválni az oldatból. Az anyag kiválása torzulást okoz a titrálási görbén. Ezt az állapotot a pH-érték finom változtatásával többször is elő lehet idézni, így a titrálási görbe ismételt torzulásaiból megadható a termodinamikai oldhatóság, illetve az első kiválási esemény koncentrációviszonyaiból a kinetikai oldhatóság is (Avdeef, 2003; Stuart, 2005). A kinetikai oldhatóságot jellegéből adódóan is sokkal könnyebb automatizált módon mérni. A korábban leírtak szerint a szilárd mintát DMSO-ban előoldják, majd pufferelt – a leggyakrabban pH 7,4-es – vizes közeghez adva 96 cellás 0,4

search

m-es szűrőmembránnal ellátott mérőlemezen (plate) rázatják. Az inkubálási idő leteltét követően az oldatot vákuumban vagy centrifugális erőtérben átszűrik egy fogadó mérőtálcába. A szűrletben az anyag koncentrációját nefelométer (Bevan, 2000), spektrofotométer (Testa, 2001) vagy LC/UV, LC/MS segítségével határozzák meg. Turbidimetria vagy nefelometria melletti végpontjelzéses módszernél, ettől eltérő módon, a vizes közeghez egészen az anyag kiválásának megkezdéséig szakaszosan adagolják a minta DMSO-val képzett törzsoldatát. Az anyagkiválást követően az oldat zavarossá válik, amit lézerfényszórás vagy az optikai denzitás segítségével 620–820 nm hullámhossz-tartományban mérnek. A kinetikai oldhatóság a DMSO-törzsoldat fogyásából számítható (Lipinski, 1997).

 

A gyógyszerkutatás kezdeti szakaszában a vegyületek oldatstabilitását elsődlegesen a releváns tápcsatornai folyadékot, a vérplazmát, illetve egyes szövetek folyadéktereit modellező rendszerekben vizsgálják. A kémiai stabilitás szempontjából legfontosabb fiziológiás közegeket és az ezekhez tartozó modelleket a 4.8.2. táblázat mutatja be. Az egyes oldat- és kémiai stabilitási vizsgálatok pontos leírása, illetve a gyógyszerkincs ismert bomlástermékeinek monográfiája a Magyar Gyógyszerkönyvben, illetve nemzetközi gyógyszerkönyvekben (európai: Ph.Eur., amerikai: USP) találhatók meg.

 

 

A kutatási gyakorlatban a fenti modellekből (a rendszerek bizonytalansága és a mátrixhatás növekedése miatt) a biológiai komponenseket a legtöbb esetben elhagyják. A mesterséges gyomornedv- (Simulates Gastric Fluid: SGF) modell esetében a pepszin jelenléte peptidkötést, illetve savamid funkciós csoportot tartalmazó vegyületek esetében indokolt. Az SGF-modellben jellemző bomlási folyamat a gyomor 1-2 pH-jú közegével összefüggő savkatalizált hidrolízis. A mesterséges bélnedv- (Simulated Intestinal Fluid: SIF) modellben a pakreatin jelenléte (lipáz, proteáz és amiláz enzimek keveréke) zsírsav- és cukorszármazékok vizsgálata esetén válik fontossá. A SIF-modellben a vegyületek jellemzően sav-, illetve báziskatalizált hidrolízis (pl. a diloxanid-furoát diloxaniddá és fumársavvá hidrolizál: Hassan, 2002) során bomlanak. A vérplazmát modellező izotóniás foszfátpuffer-rendszerben (Phosphate Buffer Saline (pH 7,4): PBS) végbemenő bomlási folyamatokra is elsősorban a sav- és báziskatalizált hidrolízis a jellemző. A fenti modellrendszerekben fontos az ionösszetétel pontos beállítása, hiszen a hidrolitikus folyamatokat az oldat ionerőssége is befolyásolhatja. A fiziológiás közegeket modellező oldatstabilitási rendszerek jellemző inkubálási hőmérséklete 37 oC. A kémiai reakciók hőmérsékletfüggése miatt az inkubálási körülmény pontos betartása nagyon fontos. Az egyes modellek esetén az inkubációs időt a hatóanyag egyes kompartmentekben való átlagos tartózkodási ideje határozza meg. SGF esetén a gyomorban való tartózkodásnak megfelelően 1 óra, SIF esetén az általánosan elfogadott inkubálási idő 3 óra. A PBS-pufferrendszert a vérplazma modellezésén túl – mivel az ember szöveti vízterei is hasonlóak és a legtöbb in vitro farmakológiai vizsgálat is hasonló közegben zajlik – általános pufferoldat-stabilitási rendszernek tekintik. Az inkubálást a modellezni kívánt fiziológiás folyamatnak megfelelő ideig (1–24 óra) végzik (Kerns és mtsa, 2008).