Keserű György Miklós (szerk.)

Gyógyszerkémia

4.8.3.1. In vitro kémiai (PAMPA) sejtes hatóanyag-penetráció- és aktívtranszport-vizsgálat

A 4.8.2.1–2. fejezetekben, bemutatásra kerültek a hatóanyag- felszívódás, illetve a szervezetben történő eloszlás (számos belépési kapun, illetve membrán rendszeren keresztül lejátszódó) transzportfolyamatai. Annak ellenére, hogy ezen folyamatok jellemzően kevert transzportmechanizmus eredményeképpen valósulnak meg, a gyógyszerkincs jelentősebb részénél a passzív transzport a domináns. Ennek megfelelően a gyógyszerkutatásban is megkülönböztethetünk olyan in vitro (főként kémiai) modelleket, melyek csak a passzív, ezen belül is a transzcelluláris transzport modellezésére alkalmasak, míg a sejtalapú in vitro modellek a passzív transzport mellett specializáltan a transzporterfehérjék által biztosított aktív transzport, illetve specifikusan a membránfüggő metabolizmus modellezésére is lehetőséget biztosítanak. A következőkben ezeknek a permeabilitási modelleknek a szélesebb körben alkalmazott rendszereire fogunk fókuszálni.

In vitro kémiai permebilitási modell – PAMPA (parallel artificial membrane permeability assay)

A PAMPA penetrációs mérési technika egy nem sejtes, két mérőtálca (plate) összeillesztésével, szendvicselrendezésben kialakított modellrendszer. A donor oldal apoláros oldószerek által nedvesedő szűrőmembránnal ellátott 96 cellás mérőtálca, míg a fogadó oldal a donor mérőtálca geometriájával harmonizáló (a donor és a fogadó mérőlemeznek jól záródóan kell egymásba csúsznia), szintén 96 cellás mérőtálca (4.8.40. ábra).

Harvard

(): . : . : /hivatkozas/m1334kgyke_2487/#m1334kgyke_2487 ()

Chicago

. . . : . (: /hivatkozas/m1334kgyke_2487/#m1334kgyke_2487)

APA

(). . . (: /hivatkozas/m1334kgyke_2487/#m1334kgyke_2487)

BibTeX EndNote Mendeley Zotero

4.8.40. ábra. A PAMPA-modellrendszer és egy mérőlyukpár elrendezése

Forrás: saját szerkesztés

A mesterséges lipidmembrán a donor mérőlemez szűrőmembránján kerül kialakításra oly módon, hogy a különböző, elsősorban természetes lipidizolátumokat szerves paraffinokban (pl. n-dodekán) oldják, majd az oldatot a mérőlemez szűrőmembránjára rétegezik. A vizsgálandó vegyület DMSO-val készített törzsoldatából vagy a vegyület szilárd formájú mintájából kiindulva a modellezni kívánt apikális kompartmenttel (gyomor, vékony-, illetve vastagbél, vér) azonos kémhatású (pH 2,0–6,5–7,4) vizes puffer felhasználásával készítik el a donor oldatot. Ez az oldat kerül a donor mérőtálcába. A fogadó mérőtálcába általánosságban az intracelulláris, illetve a vér közegének megfelelő pH = 7,4-es puffert tesznek. A két mérőtálca egymásba illesztését követően a hatóanyag a donor oldali cellából passzív diffúzióval jut át a fogadó cellába. Az inkubációs idő leteltét követően a vizsgálandó vegyület penetrációs sebességét, a donor és a fogadó oldalon kialakult koncentrációk meghatározását (UV-spektrofotométer, LC/DAD/MS) követően, az effektív permeabilitás (Pe – cm/s), illetve a vegyület membránban történő akkumulációjának a mértékét az ún. membránretenció (R) paraméterekkel jellemzik (Avdeef, 2001):

ahol A a szűrő felülete (cm2), t az inkubációs idő (s), τss az állandósult állapot beálltának az ideje (s), CD a hatóanyag koncentrációja (mol/dm3) kiinduláskor (CD(0)) és az inkubációt követően (CD(t)), VD a donor lyuk térfogata, VF a fogadó lyuk térfogata és R a retenciós faktor:

ami megfelel a lipidmembránban megkötődő hatóanyaghányadnak.

A PAMPA-rendszer az elmúlt 25 évben jelentős fejlődésen ment át. Fejlődésének iránya három alapvető paraméterének módosításával, illetve optimalizálásával, a mesterséges membrán összetételével, az alkalmazott pufferrendszerrel és az inkubálás körülményeivel köthető össze.

4.8.7. táblázat. PAMPA-rendszer változtatható paraméterei és fejlődése

Fejlődési irány	Mesterséges membrán	Pufferrendszer	Inkubáció körülményei
Harvard (): . : . : /hivatkozas/m1334kgyke_2498/#m1334kgyke_2498 () Chicago . . . : . (: /hivatkozas/m1334kgyke_2498/#m1334kgyke_2498) APA (). . . (: /hivatkozas/m1334kgyke_2498/#m1334kgyke_2498) BibTeX EndNote Mendeley Zotero search	Szövetspecifikus membrán Epitélium lipidmembránja ((BBLM) Brush-Border Lipid Membrane) BBB, máj, vese stb. Monolipid-membrán Foszfatidilkolin, foszfatidilszerin, kardiolipin stb. Oldószer-membrán n-oktanol, ciklohexán, hexadekán, dodekán	Humán szérumalbumin alkalmazása a fogadó cellában Koszolves alkalmazása a donor és a fogadó oldalon Gradiens pH-rendszer Donor cella: pH 2–8 Fogadó cella: pH 7,4 Izo-pH-rendszer pHdonor = pHfogadó	Fogadó cella kevertetése Inkubálás fiziológiás hőfokon (37 oC – test, 35 oC – bőr-, szemfelszín) Inkubálás szobahőmérsékleten Kevertetés nélküli statikus rendszer

A 4.8.7. táblázat tanulsága szerint az alkalmazott mesterséges membrán egyre összetettebbé vált idővel a kezdetben alkalmazott egyszerű oldószer-membránrendszerekhez képest (Testa, 2001; Nielsen, 2004; Di, 2003). A pufferrendszer fejlődése is a fiziológiás körülmények minél jobb modellezésére irányul. Így már modellezhetővé vált a tápcsatorna (GI) és az intracelluláris tér/vér között kialakuló pH-gradiens is. A per os adagolt gyógyszerek esetén a felszívódás főként a vékonybeleken keresztül valósul meg, ahol a közeg pH-ja jellemzően 6,5. Ennek megfelelően a felszívódás modellezésére leggyakrabban pH6,5donor – pH7,4fogadó rendszert alkalmaznak. A gradiens pH-rendszer alkalmazása, illetve hatása a vékonybél és a vér közegével azonos pH-tartományban ionizálódó (

2 pH-egység szabály) hatóanyagok (4,5 < pKa < 9,5) esetén különösen érdekes. A protondisszociációs folyamatban e vegyületek lipofil karaktere, vizes oldhatósága és így penetrációs sajátsága is jelentősen változik. Lehetőség van a vegyületek plazmafehérje-, jellemzően a szérum kötődésének modellezésére is. A fogadó oldalon jelen lévő albumin csökkenti a szabad hatóanyag koncentrációját, ezáltal fokozza a koncentrációgradienst. A lipofilebb, rossz vízoldhatóságú vegyületek esetében koszolvensek (pl. DMSO, acetonitril) alkalmazásával igyekeznek a kiindulási, donor oldali mintakoncentrációt és így az analitikai követhetőséget javítani (Ruell, 2004). A fogadó cella kevertetése, illetve a keverési sebesség növelése a membránon kialakuló stagnáló határréteg vastagságát csökkenti, ami egyúttal a hatóanyag határrétegről történő elszállításán keresztül a véráramlás dinamikus szállító és a szisztémás keringés hígító hatását is modellezi (Kansy, 2004). A PAMPA-rendszer jól reprodukálható módon, megbízhatóan, viszonylag alacsony költségen és nagy kapacitással képes nagyszámú vegyület (akár több százezer vegyület/nap) permeabilitásának meghatározására. Hátránya, hogy csak a passzív diffúziós folyamatot képes modellezni.

A permeabilitás in vitro sejtes modelljei (Caco-2, MDCK stb.)

Ezek a PAMPA-modellnél összetettebb, az idő- és költségigény tekintetében kevésbé hatékony és jóval bonyolultabb, a környezeti tényezőkre érzékenyebb sejtes permeabilitási modellek. Ugyanakkor a sejtes penetrációs modellek sokkal gazdagabb információt szolgáltatnak a hatóanyagok felszívódásáról, így a passzív diffúzióval történő felszívódás mellett lehetőség van az aktív (influx és efflux) transzport és az epitélsejtekkel összefüggő metabolikus folyamatok vizsgálatára is. A gyógyszerjelöltek penetrációjának modellezésére ipari léptékben is általánosan alkalmazott, nem natív forrásból származó sejtkultúrákat a 4.8.8. táblázat foglalja össze, ezek közül alkalmazás gyakoriság szempontjából vezető szerep tulajdonítható a Caco-2 és az MDR1-MDCK sejtvonalaknak.

4.8.8. táblázat. Sejtkultúrák a transzportfolyamatok modellezésére

	Sejt eredete	Hivatkozások
Caco-2	Emberi vastagbél-adenokarcinóma sejtvonal	Anderle (1998)
MDCK	Madin-Darby kutyavese-epitélium sejtvonal	Rothen-Rutishauser (1998)
MDR1-MDCK	mdr1 (P-gp-t kódoló) génnel transzfektált MDCK-sejtvonal	Hammerle (2000)
T24	Emberi húgyhólyag-karcinóma sejtvonal	Bubenik (1973)
ECV304	Emberi köldökvéna-endotélium sejtvonal	Takahashi (1990)

Mindkét vezető sejtvonal expresszálja a P-gp transzportfehérjét, amely a korábbi farmakokinetikai leírás szerint a gyógyszerek efflux-transzportjában vezető szerepet játszik. A sejtkultúrákban ezenfelül jelen vannak a gyógyszer-metabolizmusért felelős – a vékonybél epitéliumában is megtalálható - hidrolázok, CyP450 izoenzimek, fázis II enzimek (glutation-S-transzferáz, szulfotranszferáz, glükuronidáz). Az MDR1-MDCK sejtvonalban jelen lévő fokozott mennyiségű P-gp-nek köszönhetően lehetőség van az efflux-mechanizmusok részletes vizsgálatára, illetve az epitél sejtek rendezettsége szerinti hasonlósága miatt a vér-agy gát transzportfolyamatainak modellezésére is.

A sejtes modellek esetén, hasonlóan a PAMPA-rendszerhez, a sejteket egy rétegben a szendvics mérőtálcarendszer szűrőjére ültetik ki. Korábban a 12 és 24 cellás rendszerek voltak csupán kereskedelmi forgalomban, de újabban a 96 cellás mérőtálcarendszerek is elérhetők. Ennek ellenére a sejtvonalak könnyebb kezelhetősége és optimális geometriai sajátságai miatt a 24 cellás, közepes áteresztőképességű (MTS) rendszer alkalmazása vált általánossá. A sejtek a mérés megindításához szükséges stacioner állapotot és a megfelelő sejtsűrűséget (5–8 × 105 sejt/cm2) 7–15 nap után érik el. A hatóanyag-koncentráció változását (Cdonor,t0 ~ 5–10 μM) a donor és a fogadó cellákban jellemzően LC/UV, LC/MS technikával követik. A hatóanyag penetrációs készségét a sejtes modellek esetében látszólagos permeabilitással (Papp) jellemzik (4.8.41. ábra).

A rendszer összeállításakor a sejtmorfológia, illetve az aktív transzportért felelős fehérjék jelenléte miatt fontos az apikális és a bazolaterális oldalak megkülönböztetése. Az efflux/influx transzportfolyamatokat a különböző irányból (bazolaterális

apikális, apikális

bazolaterális) indított transzportnak megfelelő Papp értékek arányából számított ún. PDR (permeability directional ratio) értékkel jellemzik.

Amennyiben PDR > 1, illetve átlépve ezt a határt, minél nagyobb értéket vesz fel, annál fokozottabb a vizsgált vegyület efflux-transzportja. Míg ha a PDR < 1, akkor a vizsgált molekula influx-transzporter-szubsztrátja.

Harvard

(): . : . : /hivatkozas/m1334kgyke_2508/#m1334kgyke_2508 ()

Chicago

. . . : . (: /hivatkozas/m1334kgyke_2508/#m1334kgyke_2508)

APA

(). . . (: /hivatkozas/m1334kgyke_2508/#m1334kgyke_2508)

BibTeX EndNote Mendeley Zotero

4.8.41. ábra. Az in vitro permeabilitás sejtes modellje, egy cellapár és jellemző paramétereinek (Papp, PDR, visszanyerés%) megadása

Forrás: saját szerkesztés

Hasonlóan a PAMPA-rendszerhez, a sejtes alapú permeabilitási modell esetén is számolni kell a hatóanyag koncentrációjának transzportfüggetlen változásával. Ez az esetek nagyobb hányadában a vizsgált vegyület fokozott lipofilitásával van összefüggésben, és a sejt membránjához, vagy a mérőtálca anyagához történő kötődéssel, illetve a metabolikus enzimek jelenlétével azonosítható folyamatok eredménye. A sejtes rendszerben a vizsgált vegyület ezen mechanizmusokhoz kapcsolódó, nem penetrációs folyamattal összefüggő vegyületfogyását a visszanyerés (recovery) %-kal jellemzik. A sejtes modell által szolgáltatott Papp érték akkor elfogadható, ha ez az érték 80–120% közé esik.

A sejtes penetrációs modellek esetében is lehetőség kínálkozik az inkubációs körülmények változtatására. Az izo-pH-rendszer mellett itt is alkalmazhatók gradienspH-rendszerek (pH6,5donor–pH7,4fogadó, Neuhoff, 2005). A sejtes rendszer pH-érzékenysége azonban sokkal kifejezettebb, így alkalmazása szűkebb pH-tartományban lehetséges, mint a PAMPA-modellé. Végül megjegyzendő, hogy a sejtes penetrációs modellek is alkalmasak a hatóanyagok szérumalbumin-kötődésének modellezésére (Yamashita, 2000).

Összességében a sejtes permeabilitási modellek előnye, hogy a passzív diffúzió mellett képesek az aktív transzportot és a metabolikus folyamatokat is modellezni. A 96 cellás mérőlemezek megjelenése biztosítja a megfelelő áteresztőképességet. Hátránya, hogy a megfelelő sejtsűrűség elérése, az egyrétegű belépési kapu biztosítása viszonylag hosszadalmas (7–15 nap), ezért hosszú előkészületet igényel. A komplex biológiai rendszer és annak mátrixhatása miatt a sejtes modellek reprodukálhatósága és robusztussága jellemzően elmarad a PAMPA-rendszerrel szemben.

A hatóanyagjelöltek penetrációs készségének gyógyszerkémiai vonatkozásaival kapcsolatos fontosabb irányelvek a fizikai kémiai és farmakokinetikai sajátságok tárgyalása során már bemutatásra kerültek. A szerkezetmódosító irányelvek főként a passzív transzporttal összefüggésben fogalmazhatók meg és alapvetően a mesterséges lipidmembrán, illetve a sejtmembrán molekuláris összetételéből és fizikai kémiai sajátságából adódnak. Így a vegyület vízoldhatósága és a biológiai vagy mesterséges lipidmembránnal szembeni affinitása meghatórozó a penetráció szempontjából. A vízoldhatóság biztosítja a szabad hatóanyag forma koncentrációját és egyúttal a folyamat hajtóerejét, azaz a koncentrációgradienst. Ezzel és a membránaffinitással is szorosan összefügg a vegyületek protondisszociációs (pKa) készségének és lipofilitásának pH-függő sajátsága. Így a transzcelluláris penetráció szempontjából előnyt jelent az amfifil vegyületsajátság, ami sav-bázis karakter esetében protondisszociáció révén biztosítja a vízoldhatóságnak kedvező ionos, azaz poláris formát (PSA < 140

2), míg az apoláris rész a membrántranszporthoz köthető lipofil karaktert szolgáltatja (logPoptimális ~ 1–3). A sav-bázis sajátság szempontjából fontos megemlíteni a sejtmembránokat felépítő, mennyiségében a nagyobb hányadban jelen lévő glicerofoszfolipid-családot, amelyben a tagok nettó töltése a fiziológiás terek által biztosított pH-értékeken ikerionos (nettó semleges – pl. foszfatidil-kolin, foszfatidil-etanolamin) vagy anionos (pl. foszfatidil-szerin, foszfatidil-inozit) karakterű. Ezzel magyarázható, hogy a lipofilitáson kívül a bázikus karakter segíti, míg az anionos vagy savas karakter csökkenti a passzív transzport folyamatát. Fontos azonban kiemelni, hogy ezen megfontolások, hasonlóan a Lipinski által megadott szabályra (ami szintén alkalmazható a permeabilitásfüggő szerkezet optimalizálásban), csak a passzív transzporttal „közlekedő” molekulák esetében használhatók. Az aktív transzporttal összefüggő szerkezetmódosító stratégiák a gyógyszerkémia rögösebb útját képviselik.

Tartalomjegyzék

Kiadó: Akadémiai Kiadó

Online megjelenés éve: 2026

ISBN: 978 963 664 145 0

Kémia

A kötet az Akadémiai Kiadónál 2011-ben Gyógyszerkutatás kémiája címen megjelent kézikönyv hagyományaira alapozva a kismolekulás gyógyszerkutatás eszköztárára és módszertanára fókuszál. Újdonságot jelent a magyar nyelvű szakirodalomban, hogy a modern gyógyszerkémiai felfogásnak megfelelően nem pusztán a meglévő gyógyszerkincs kémiáját mutatja be, hanem betekintést enged a kismolekulás gyógyszerek felfedezésének stratégiájába is.

Hivatkozás: https://mersz.hu/keseru-gyogyszerkemia//

BibTeX EndNote Mendeley Zotero