A gyógyszerkutatásban általánosan elfogadott (gold standard) módszerek a plazmafehérje-kötődés (PPB) mértékének a meghatározására az egyensúlyi dialízisen alapuló technikák (Banker, 2003). A kereskedelmi forgalomban elérhetők egyedi, de akár a 96 cellás, mérőlemez-alapú rendszerek is. A PAMPA-rendszerhez hasonlóan egy cellapár-alapú rendszerben a cellákat különböző molekulaméret- (8–12–30 kDa) levágású, jellemzően cellulóz alapanyagból készült féligáteresztő membrán választja el egymástól. A cellapár donor oldalára kerül a vizsgált vegyület humán vagy kísérleti állat izolált plazmájával, de akár más in vivo források izolált, vizes pufferrel izotóniásra állított szérumalbumin-oldattal készült, jellemzően pár tíz μM kiindulási koncentrációjú oldata. A fogadó oldalra szintén izotonizált, a donor oldallal azonos pH-értékű és elektrolit-összetételű tiszta oldat kerül. A nem kötött gyógyszerhányadot (fu) a 4.8.42. ábrán bemutatott rendszerben és a megadott egyenlet alapján határozzák meg. A vizsgált vegyület donor és fogadó oldalon kialakuló egyensúlyi koncentrációjának mérése az esetek többségében LC-MS technikával történik. Ebben az elrendezésben a membránnak köszönhetően a fehérjének nem, csak a kismolekulás vegyület nem kötött formájának van szabad mozgása. Emiatt a fehérjekoncentráció gradiense a hatóanyag fluxusával a vízmolekulák ellenkező irányú passzív transzportját indukálja, ami donor oldali térfogatemelkedést okoz. Ennek kompenzációja a 4.8.42. ábrán látható 96 cellás rendszerekben (valójában 48 cellapár, pl. a Thermo Fisher Scientific: Rapid Equilibrium Dialysis – RED-rendszere), a gyorsított vizsgálati módszer biztosítása miatt, már a kiindulási térfogatok eltérő beállításával megvalósul.

 

A PPB-vizsgálat ideje jelentősen csökkenthető ultraszűréssel, ahol az alkalmazott membrán levágási értéke jellemzően 30 kDa, a vizsgált vegyület nem kötött hányadot tartalmazó oldatának a centrifugális erőtérben (2000 g) végzett elválasztása 1 órán belül elérhető. Az ultracentrifugálás a szedimentációs erőtérben biztosítja az albuminhoz kötött és a vizsgált hatóanyag nem kötött formáját tartalmazó felülúszó oldat elválasztását. A szedimentáció 6 óra alatt elérhető 160 000 g centrifugális erőtérben (Barre, 1985). További gyors vizsgálati megoldást jelent a szilárd hordozóhoz (egyszerű szilikagélhez vagy lipidekkel módosított álló fázishoz) rögzített HSA-, illetve AAG-kromatográfiás oszlopok alkalmazása gyors gradienselúciós módszer segítségével. A fordított fázisú HPLC-rendszerben végzett vizsgálatban a vizsgált vegyület és az immobilizált fehérje közötti affinitás mértéke a minta elúciós (retenciós) idejével (tR) arányos. A vizsgálatban a kromatográfiás faktor (logk = log((tR–t0)/t0)), ahol t0 a rendszer holtideje) és az in vivo vagy plazmaminta egyensúlyi dialízissel nyert kötődésmértéke (HSA%) közötti kapcsolat biztosítja az fu,plazma meghatározását. A logk–HSA% (AAG%) vagy az fu összefüggés ismert gyógyszerek kötődési adatainak felhasználásával kapott kalibráció segítségével nyerhető (Valkó, 2003). Az fu főként egyes szövetekhez (pl. agy, máj, szem üvegtest) kapcsolódó in vivo vizsgálatára szolgálnak a speciális kialakítású, vizes pufferrel állandó átáramoltatású mikrodialízis-mintavevők. Ebben az esetben a vizsgált szövetbe beszúrt mintavevő hegyén kialakított féligáteresztő membrán biztosítja az adott szövetet elérő szabad hatóanyag hányadának meghatározását. Tekintettel az igen nagy hatóanyag-hígulásra, ebben az esetben csak a közvetlen vagy HPLC-kapcsolt nagy felbontású (HR)-MS technikák alkalmazása segíthet a vizsgált vegyület szabad koncentrációjának meghatározásában (Azeredo, 2014).