A hatóanyagjelöltek májhoz köthető metabolikus folyamatainak vizsgálata a teljes gyógyszerkutatási folyamatot átöleli. A felfedező és alapvetően a prekliniai szakasz nagyobb részében a különböző szintű in vitro modellek, így hierarchikus sorrendben: az izoláltmáj-perfúzió, májszelet, hepatociták (szelektált májsejtek), rekombináns CyP450 enzimek és a máj szubcelluláris izolátumán, a mikroszómán alapuló modellek alkalmazása kerül előtérbe. A fejlesztési szakaszban viszont az in vivo állatokon, végül főként a fázis I vizsgálatokban az in vivo humán farmakokinetika részeként a gyógyszer-metabolizmus vizsgálatára is sor kerül. Tekintettel arra, hogy a korai fázisú metabolizmusvizsgálatban a „gold standard” eljárás a májmikroszóma-izolátumon alapul, a következőkben ezt az in vitro modellt mutatjuk be részletesebben bemutatásra. A máj mikroszómafrakciója a májsejtek vagy hepatociták endoplazmatikus retikuluma, ahol a membránba ágyazva nagy mennyiségben vannak jelen a CyP450 és UGT izoenzimek, így ez a vizsgálati rendszer a gyógyszerek jelentősebb (gyakoribb) fázis I és fázis II folyamatainak modellezésére ad lehetőséget. A mikroszómát a 4.8.43. ábrán látható módon, állati (patkány, egér, nyúl, kutya, majom), illetve post mortem emberi májból frakcionált centrifugálás–ultracentrifugálás segítségével izolálják. Fontos még megemlíteni, hogy az (izo)enzim-polimorfizmus, vagyis az egyedi eltérések kivédésére a preklinikai állatokat a máj izolálást megelőző héten PXR-úton ható indukálószerrel (pl. barbiturátszármazékokkal) előkezelik. A post mortem emberi mikroszóma izolálásához 20–25 eltérő életkorú, nemű és rasszból származó ember összevont (pooled) májhomogenizátumát használják. A kapott mikroszómaizolátum, –80 oC-os tárolás mellett, több hónapon–fél éven át felhasználható. A mikroszómaizolálás első, centrifugálási lépésében (9000 g) nyerhető az ún. S9 frakció, melyet szintén felhasznál a gyógyszerkutatás, az elsősorban fázis II-átalakulásra specifikus enzimkészlet eltérése miatt (4.8.43. ábra B).

 

Az in vitro májmikroszóma-alapú metabolikusstabilitás-vizsgálat első lépésében a jellemzően 10–20 mg/ml fehérjetartalmú nyers mikroszómaizolátumot vizes pufferben (pH7,4) szuszpendálják. Ezt követően hozzáadják a rendszerhez a CyP450 enzimek kofaktorait (NADPH, glükóz-6-foszfát (G6P), G6P-dehidrogenáz), illetve az UGT-konjugációval is kiegészített rendszerhez az uridin-difoszfát-glükuronsav- (UDPGA) prekurzor adagolása is szükséges. Ezt követően a vizsgálandó vegyületet a mikroszómával 37 °C-on inkubálják, majd adott, kinetikailag releváns időpontokban (jellemzően 0–1 óra között) a párhuzamosított mikroszómarendszereket előhűtött szerves oldószer (pl. 4 °C-os MeOH) segítségével pillanatszerűen leállítják. A hűtés és a szerves oldószer együttes hatására az enzimek denaturálódnak, így a metabolikus folyamatok azonnal befagyasztódnak. A kapott mikroszómaszuszpenziót centrifugálják (20 000 g, 15 perc), a metabolikus átalakulásokat a kapott felülúszók szerves-vizes fázisból LC/UV/MS segítségével vizsgálják. A folyamat viszonylag jól párhuzamosítható, így az elmúlt években több 96 cellás mérőlemezen alapuló automatizált eljárás is kidolgozásra került (Jenkins, 2004; Di, 2006). Ennek megfelelően a mikroszomális metabolikus vizsgálat nagyszámú vegyületen is viszonylag gyorsan elvégezhető. A vizsgálat alapján a vegyületek metabolikus stabilitása több módon is megadható. A metabolikus stabilitás %-os megadásánál a vizsgálandó vegyületek mikroszomális inkubációját azonos időben állítják meg. A stabilitási %-ot az adott kinetikai időpontban kialakuló és a vizsgálat kezdetén (0. időpontban) mért hatóanyag-koncentrációk hányadosaként adják meg. Fontos kiemelni, hogy a vizsgált vegyület (szubsztrát) koncentrációját a fiziológiás viszonyok és a farmakokinetikai egyszerűsített számítás miatt szükséges minél alacsonyabban tartani. Így a 10–20 mg/ml fehérjetartalmú nyers mikroszómarendszerben 1–10 μM koncentrációban alkalmazhatók a szubsztrátok, biztosítva ezzel a biotranszformáció első rendű kinetikáját. Ennek megfelelően az anyavegyület %-os fogyásának logaritmizált értékét ábrázolva az idő függvényében, a kapott lineáris illesztés meredeksége megadja a metabolikus folyamat sebességi állandóját (k), illetve az első rendű kinetikának köszönhető felezési idő (t1/2) is könnyen számolható. Ez a 4.8.44. ábrán bemutatott közelítő egyenletek alapján egy a preklinikai–humán transzláció szempontjából kiemelt farmakokinetikai becslési adathoz, a belső vagy intrinzik klírensz (Clint) megadásához vezet. A Clint azon túl, hogy a vegyületek hepatikus kiürülésének jól használható jelzőszáma, egyúttal alkalmas a teljes szisztémás klírensz (Clsys) becslésére is, ami segítséget adhat a humán első dózis becslésében is. A 4.8.44. ábrán látható, humán és preklinikai állatokból izolált májmikroszóma adatai nem csupán a Clint számolásában, de a fajok közötti transzlációban is segítséget nyújtanak.

 

LC/HR-MSn és főként major metabolitok esetében az izolált komponensek NMR-vizsgálatával a mikroszomális rendszerben a keletkező metabolitok és ezen keresztül a vizsgált vegyület metabolikusan érzékeny pontjai is azonosíthatókká válnak, ami nagy segítséget nyújt a szerkezet finomhangolásában, optimalizálásában. Az izolált vagy rekombináns enzimeken végzett vizsgálatok segítséget nyújthatnak a vegyületek izoenzimspecifikus gátlásának, esetleges indukciójának feltárásában. A metabolitok azonosítására az egyes nagyműszeres rendszerekre specifikus szakértői szoftverek állnak rendelkezésre (Banerjee, 2024), míg a izoenzimspecifikus in vitro vizsgálatokat a gyógyszerhivatalok (FDA, EMA) által elfogadott markerszubsztrátok, illetve azok igazolt biotranszformációs metabolitjainak ismeretei segítik (EMA:www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/draft-ich-guideline-m12-drug-interaction-studies-step-2b_en.pdf; FDA:www.fda.gov/drugs/drug-interactions-labeling/healthcare-professionals-fdas-examples-drugs-interact-cyp-enzymes-and-transporter-systems).