A gyógyszerkutatás egyéb területeihez hasonlóan a vegyületek korai toxicitási szűrésére is kiterjedten alkalmaznak in vitro vizsgálati módszereket. Ugyanakkor a későbbi klinikai jelölt választásához közeledve olyan in vitro módszereket is használnak, melyek az egyes specifikus toxicitási mechanizmusokkal összefüggő szerkezet–toxikus hatás összefüggések feltárásra is alkalmasak. Az alábbiakban az ipari gyógyszerkutatásban gyakrabban, fókuszáltan alkalmazott in vitro toxicitási módszereket mutatjuk be. Tekintettel arra, hogy a gyógyszerkutatásban kiemelten fontos a gyógyszerbiztonság, illetve a potenciális mellékhatások minimalizálása, a toxicitási vizsgálatokra vonatkozó egységes vizsgálati körülmények biztosítására a Nemzetközi Harmonizációs Bizottság (ICH) részletes leírással szolgál a kritikusnak értkelt in vitro toxicitási vizsgálatok esetében (www.ich.org/page/safety-guidelines).

 

A genotoxicitási vizsgálat fókuszában a magasabb rendű preklinikai állatok és az ember genetikai anyaga károsodásának átfogó feltárása, azonosítása áll. A genotoxicitás főbb formáinál a háttérben a mutagenitás kifejeződése, azaz a DNS károsodásának és más genetikai elváltozásnak az indukciója áll, amely egy vagy néhány DNS-bázispár változásával (génmutáció) jár. Régóta ismert, hogy egyes xenobiotikumok vagy azok keverékei a rákos elváltozások kialakulását az expozíciót követően, időben eltolódva, később idézik elő, illetve ezek egy része öröklődő változásokat is indukálhat az emberben. Így a hatás több generáción keresztül is megvalósulhat. Ezen okokra vezethető vissza, hogy a széles körben használt gyógyszerek, de különösen a potenciális klinikai fázisra kiválasztott új gyógyszerjelöltek esetében kritikus kérdéssé vált, hogy károsítják-e a DNS-állományt. Emiatt a gyógyszerkutatás fejlesztési szakaszában ezen információ birtokában fontos döntési pontot jelent a genotoxicitási vizsgálat eredménye a gyógyszerjelöltek további sorsát illetően. A hatóanyag genotoxicitására vonatkozó adatok mára a gyógyszerbiztonsági elemzés részévé váltak. Egy hatóanyag mutagenitása számos in vitro és in vivo technikával vizsgálható, és eldönthető, hogy az illető anyag okozhat-e mutációt, kromoszómakárosodást, esetleg rákot, vagy sem. A mutáció lehet pontmutáció vagy DNS-károsodás okozta kromoszómaátrendeződés. Ezért szükséges vizsgálni a hatóanyag hajlamát pontmutáció, kromoszómaváltozás vagy DNS-károsodás kiváltására. Bár a mutagenitás és a karcinogenitás nem csereszabatos kifejezések, köztük szoros korreláció figyelhető meg. Míg a legtöbb karcinogén anyag mutagén, a mutagén anyagok nem feltétlen okoznak rákot emberben. A DDI-vizsgálatok mellett a hatóanyagok preklinikai fejlesztésre való kiválasztásának feltétele általában az, hogy az Ames-teszten és valamilyen általános citotoxicitási teszten ne mutassanak hatást. Így az első, emberben végzett vizsgálathoz („first in human, FIH”) fontos egy in vitro emlőssejten végzett mutációs teszten (CHO vagy egérlimfóma) kapott negatív eredmény is. A klinikai fejlesztés során pedig in vivo emlősmutációs tesztre van szükség (pl.: rágcsálómikronukleusz-teszt). Az alábbiakban a leggyakoribb tesztrendszereket ismertetjük, melyeket sok esetben kiegészítenek a tesztvegyület metabolikusan aktivált formájával (májsejtek S9-frakciója és enzim-kofaktorok hozzáadása mellett), ami igazolhatja a keletkező reaktív metabolitok genotoxicitiását is (Bak, 2024).

 

Az Ames-teszt annak a megállapítására szolgál, hogy egy vegyület vagy (reaktív) metabolitja képes-e DNS-mutációkat okozni. A teszt a pontmutáció során kialakuló leolvasási kereteltolódást és a bázispár-helyettesítést észlel. A standardizált vizsgálatban Salmonella typhimurium négy (TA100, TA98, TA1535, TA1537) és Escherichia coli egy (WP2uvrA) speciális mutáns törzsét egy éjszakán át tenyésztik tápközegben. Ezt követően adják hozzá a tesztvegyületet (jellemzően tálcán 5 mg-ot), esetenként a reaktív metabolitok képzéséhez a máj S9-frakcióját és a metabolikus kofaktorokat, majd a rendszert 1 órán át inkubálják. Ezt követően az oldatot agarral összekeverik, és mérőtálcán további 72 órán át inkubálják, majd megszámolják a telepek számát (Bak, 2023). A fokozódó sejtosztódás, a telepek nagyobb száma nagyobb mutációs rátát jelez. Az Ames-teszt mechanisztikus hátterében az áll, hogy az alkalmazott baktériumtörzsek bázispár-deléciókat tartalmaznak, amelyek miatt csak kiegészítő hisztidin (Salmonella törzsek), illetve triptofán (E. coli törzsek) jelenlétében képesek növekedni. Ha a hisztidin vagy triptofán bázispár delécióinak helyén olyan mutáció következik be, hogy működőképes enzim képződik, a következő baktériumgeneráció a kiegészítő aminosavak nélkül is képes lesz növekedni. Következésképpen minél több baktériumtelepet észlelünk, annál mutagénebb volt maga a vegyület vagy a belőle képződő metabolit.

 

Hasonlóan az Ames-teszthez, az egérlimfóma-teszt is azon vegyületek azonosítására szolgál, melyek bázispár-helyettesítéssel vagy leolvasási kereteltolódások révén okoznak mutációt emlőssejtekben. A vizsgálat a timidin-kináz (TK) gén mutációjára szolgál, melyben egy nem funkcionális forma keletkezik. A TK alapfunkciója a timidin foszforilálása, mely során timidin-monofoszfát (TMP) képződik. A TMP koncentrációja szabályozza a DNS-szintézis sebességét emlőssejtekben. A vizsgálat során timidinanalógot, trifluor-timidint (TFT) adunk a sejtekhez a tesztvegyülettel történő kezelést követően. A natív TK-val rendelkező sejtek elpusztulnak, de a TK-mutációval rendelkező sejtekre nincs hatással a TFT. A vizsgálatot szintén el lehet végezni magával a tesztvegyülettel vagy együtt adva az S9-frakcióval és kofaktoraival. A tesztvegyülettel az egérlimfóma-sejteket 4 órán át kezelik, majd a kezelés után a sejteket centrifugálják és mossák annak érdekében, hogy a tesztvegyületet eltávolítsák. Ezt követően további 2 napig inkubálják a sejttenyészetet. A sejteket ezután TFT-t tartalmazó 96 lyukú mérőtálcákba teszik át, és további 14 nap elteltével megszámolják a sejtkolóniákat. Az élő kolóniák száma a tesztvegyület mutagén hatását jelzi (Lloyd, 2012).

 

A mikronukleuszteszt olyan vegyületek vizsgálatára szolgál, melyek közvetlenül a kromoszómát vagy a sejtosztódási rendszert képesek károsítani azáltal, hogy rendellenes DNS-fragmenseket hoznak létre. Így a mitózisban a kromoszómák nem fognak megfelelően vándorolni a centromer károsodása vagy hiánya miatt. A folyamat hatására keletkező DNS-fragmenseket nevezzük mikronukleuszoknak, melyek a membránokhoz tapadva mikroszkóppal könnyen azonosíthatók, megfigyelhetők. Az egypontos vizsgálatban a sejteket a 10 mM-ban jelen lévő tesztvegyülettel inkubálják, metabolikus aktivitás mellett (S9) vagy anélkül. A további inkubáció során az esetleges kromoszómakárosodás hatására megjelennek a mikronukleuszok, melyeket festéses technikával tesznek könnyebben azonosíthatóvá a mikroszkópos vizsgálathoz. A mikronukleuszokat tartalmazó sejtek számossága, a mérési pozitivitás reprodukálhatósága és a vegyülettel szembeni koncentráció-összefüggés támasztja alá a genotoxicitási hatást (Lang, 2006).

 

Citotoxikusnak tekintjük azokat a vegyületek melyek az élő sejtek pusztulását képesek előidézni. A citotoxicitási tesztek különböző mechanizmus révén megvalósuló olyan sejtpusztulási folyamatok vizsgálatára nyújtanak lehetőséget, ahol a vizsgált vegyület a sejt normális működését gátolja vagy sejtek pusztulásához vezet. A hepatocitákon végzett citotoxicitási vizsgálatok különösen előnyösek, mert így mind a tesztvegyület, mind annak metabolitjai által kiváltott toxicitást azonosítani tudjuk.

 

MTT humán hepatotoxicitási vizsgálat

Az MTT vizsgálat a vizsgált vegyületek humán hepatocitákra gyakorolt toxicitását méri, ahol a hepatocita mitokondriumának egészséges működését mutatja a sárga színű 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólium-bromid (MTT) lila színű formazánná történő redukálása. A formazán koncentrációja spektrofotometriásan mérhető kihasználva az 570 nm-en detektálható fényelnyelési maximumát. A vizsgálatban a humán hepatocitákat szélesztjük, és két napig inkubáljuk a sejttenyészetet. Ezt követően adjuk a sejtkultúrához a tesztvegyületet 10–1000 µM koncentrációtartományban, majd további 24 órán át inkubáljuk a tesztrendszert. Ezután a vegyületet tartalmazó tápközeget eltávolítjuk, és MTT-t tartalmazó táptalajra cseréljük. 3 órás inkubálás után a sejteket lizáljuk, a formazánt szerves oldószerrel extraháljuk, majd a kapott oldat elnyelését 570 nm-en mérjük. A kontrollnál alacsonyabb abszorbancia jelzi a tesztvegyület toxikus hatását. A citotoxicitási vizsgálatokhoz használt további színezékek a 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-3(3-karboxi-metoxi-fenil)-2-(4-szulfofenil)-2H-tetrazólium (MTS) és a (2,3)-bisz-(2-metoxi-4-nitro-5-szulfenil)-(2H)-tetrazólium-5-karboxanilid (XTT). Az MTT-vizsgálatokban esetenként aranyhörcsögsejteket is használnak. Tekintettel arra, hogy ezekből a sejtekből hiányoznak a metabolizáló enzimek, ezekhez a vizsgálati rendszerekhez gyakran a máj S9-frakciót és kofaktorait is hozzáadják (Sazonova, 2022).

 

A citotoxicitás egyik jele, hogy az elhalt sejt plazmamembránja lizál, és így a sejt extracelluláris tartalma (számos citoszólban jelen lévő enzimet is beleértve) a tápközegbe kerül. Az egyik nagy mennyiségben felszabaduló enzim a laktát-dehidrogenáz (LDH). Az LDH koncentrációját egyszerű kolorimetriás reakció segítségével lehet mérni. A kísérletes rendszerben a sejttenyészetet a vizsgált vegyülettel együtt inkubálják különböző koncentráció-tartományokban, 24 órán keresztül. Ezt követően a tápközeg izolálását követően LDH-aktivitásra egy olyan tesztkészlettel (Roche) kezelik, amely kvantitatívan termel formazánt, melynek spektrofotometriás mérése 490 nm-en történik (Kaja, 2015). Az LDH teszt mellett a sejtek lízise során felszabaduló egyéb enzimek (alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz) vizsgálatára is ismertek kidolgozott módszerek, melyekre most itt nem térünk ki.

 

A rágcsálóembriók tanulmányozásán alapuló in vivo fejlődési toxikológia mellett a teratogenitás vizsgálatban újabb modellnek tekinthetők a zebrahalembriókon végzett tesztek. A zebrahal kicsi (a kifejlett egyed 2,5–4 cm) és a különböző vizsgálati rendszerekben könnyen kezelhető, így a zebrahal embriói akár 384 lyukú mérőtálcán is vizsgálhatók, ami igen kis mennyiségű tesztvegyületen történő vizsgálatot is lehetővé tesz. A teratogenitási vizsgálatok specifikus fejlődési végpontjai méretük és átláthatóságuk miatt könnyen azonosíthatók, így a mérőtálcák leolvasására alkalmas mikroszkópiás technikák segítségével az embrionális rendellenességek könnyen megfigyelhetők (Jargue, 2020).