A vezérmolekula-optimalizálás célja egy hatékony és biztonságos gyógyszerjelölt azonosítása, amely beléphet a preklinikai fejlesztés fázisába, majd annak sikeres befejeztével humán klinikai vizsgálatok indíthatók vele. Az alábbiakban azon általános irányelveket tekintjük át, amelyeket követve és teljesítve sikert remélhetünk. A bemutatott irányelveket követi a vezérmolekula-optimalizáláshoz használt (egyre összetettebb és költségesebb) vizsgálatok egymásra épülése, a vizsgálati kaszkád (5.1.1. ábra).

Bizonyítják-e az elvégzett biokémiai vizsgálatok, hogy a gyógyszerjelöltünk szelektíven hat kölcsön a biológiai célpontjával, és ez a kölcsönhatás a kívánt funkcionális változáshoz (pl. gátlás, aktiválás) vezet?

Ennek a kérdésnek a megválaszolásához fontos, hogy megbízható biokémiai vizsgálati módszerekkel rendelkezzünk mind a célpontunkkal, mind az egyéb nem támadandó (off-target) fehérjékkel való kölcsönhatás vizsgálatára. A vezérmolekula-optimalizálás folyamatában fontos, hogy tudjuk, milyen szelektivitást kell elérnünk a nem támadandó fehérjékkel szemben. Egyes esetekben az is előfordulhat, hogy a több fehérjével való kölcsönhatás kívánatos lehet. Ilyenkor ezek monitorozása és az elvárt szelektivitás meghatározása ugyanilyen fontos.

 

Bizonyítottnak tekinthető-e, hogy a sejtes modellrendszerben megfigyelt funkcionális válasz ( fenotípus ) a biológiai célpontunk szelektív támadásából ered?

Ennek a kérdésnek a megválaszolásához általában többféle sejtes vizsgálati módszer együttes alkalmazására van szükségünk. Elsőként fontos meggyőződnünk arról, hogy a gyógyszerjelöltünk be tud jutni a sejt megfelelő részébe és ott kölcsönhatásba kerül a biológiai célpontjával (target hitting). Ideális esetben ezen vizsgálat alkalmas arra, hogy dózisfüggő választ mutasson, valamint gyakran azt is fontos kimutatni, hogy a sejten belül a nem támadandó (off target) célpontokkal nincs számottevő kölcsönhatása a bejutott gyógyszerjelöltnek. A következő lépésben arra keressük a választ, hogy a biológiai célpontunkkal való szelektív kölcsönhatás a sejten belül a várt funkcionális választ (fenotípust) eredményezi-e, és a válasz dózisfüggése összhangban van-e a célponttal való kölcsönhatás mértékével. Végezetül hasonlóan fontos megmutatni, hogy olyan sejtvonalakon, ahol a biológiai célpontunk modulálásától nem várunk sejtes hatást, ott nem is figyeljük meg. Az ilyen funkcionális vizsgálatoknál is célszerű meghatározni az elvárt szelektivitást a különböző sejtvonalak között.

 

Bizonyítottnak tekinthető-e, hogy az in vivo rendszerben megfigyelt funkcionális válasz a biológiai célpontunk szelektív támadásából ered?

Ennek a kérdésnek a megválaszolásához elsőként azt vizsgáljuk, hogy a gyógyszerjelöltnek a vizsgálti állatban (plazmában vagy a célszervben) mért koncentrációja (expozíció) és a korábbi sejtes vizsgálatok alapján milyen mértékű funkcionális választ várhatnánk, és hogy ez összhangban van-e az in vivo kísérletben megfigyelttel. Ezekben a kísérletekben fontos, hogy legalább két különböző aktív dózisban legyenek eredményeink, és ezek a megfelelő expozíció–hatás összefüggést mutassák, amit PK–PD (farmakokinetika–farmakodinámia) kapcsolatnak is nevezünk. Érdemes megemlíteni, hogy a sejtes vizsgálati körülmények csak imitálják az in vivo körülményeket, például a plazmafehérjék mennyisége jelentősen eltérhet, így egzakt matematikai kapcsolatot nem várhatunk, csak közelítő jellegűt.

 

Bizonyítottnak tekinthető-e, hogy az in vivo betegségmodellben megfigyelt változás a biológiai célpontunkkal való szelektív kölcsönhatásból ered?

Ennek a kérdésnek a megválaszolásához a PK–PD kapcsolat és a betegséggel szembeni hatékonyság közötti korrelációt kell megvizsgálnunk. Fontos tudnunk, hogy a betegségmodellben a hatékony válaszhoz mennyi ideig és milyen mértékben kell kölcsönhatnunk a biológiai célpontunkkal. Vannak olyan célpontok, mint például a jelátviteli utak gátlása, ahol a rendszerszintű hatás eléréséhez a célpont folyamatos és magas fokú (90% feletti) gátlása kell. Más esetben, például a programozott sejthalál beindításához, elegendő lehet a biológiai célponttal való rövidebb idejű kölcsönhatás, mert a sejten belül ez visszafordíthatatlan változásokat indít el. Ezért vizsgálnunk kell, hogy az alkalmazott adagolási útvonal, gyakoriság és dózis mellett a gyógyszerjelölt farmakokinetikai sajátságai (szabad koncentrációjának változása az állatmodell megfelelő szervében az idővel), az észlelt farmakodinámiás hatás (a célszervben mért sejtes funkcionális hatás) és ezek alapján az állati betegségmodellben várt hatékonyság összhangban vannak-e egymással. Fontos, hogy ezt az összefüggést különböző dózisok és adagolási ütemezések mellett is vizsgáljuk. Amennyiben a sejtes funkcionális válaszhoz képest a betegségmodellben túl gyenge vagy túl erős választ tapasztalunk, az egyformán figyelmeztető jel, és arra kell, hogy sarkalljon, hogy alaposabb vizsgálatokat végezzünk, mielőtt továbblépnénk a korreláció hiányának magyarázatára.

 

 

A gyógyszerjelöltünk fizikai kémiai sajátságai alapján megfelelhet-e az elvárásainknak?

Vizsgáljuk a gyógyszerjelölt rendelkezésre álló formájának (kristályos vagy amorf) pH-függő oldódási, oldhatósági és oldatstabilitási profilját. Amennyiben orális adagolást tervezünk, úgy a vizsgálatok tartalmazzák a szimulált emberi gasztrointesztinális folyadékokban való oldhatóságot, beleértve a táplált és éhomi állapotot is. A felszívódás szempontjából fontos, hogy a különböző pH-jú és összetételű gyomorban és béltraktusban a gyógyszerjelöltünk a szükséges mértékig fel tudjon oldódni. Az oldatként való adagolás (pl. intravénás, szubkután) esetén fontos, hogy kellően koncentrált oldatot tudjunk előállítani a kívánt pH-tartományban (jellemzően pH 5–9 között).

 

Az in vitro és in vivo eredmények megbízhatóan megjósolják-e a felszívódást és lebomlást az emberi szervezetben?

Erre a kérdésre azért fontos választ kapnunk, mert az emberi vizsgálatok elkezdése előtt ki kell választanunk az első alkalmazandó humán dózist. Ha ezt túl alacsonyra választjuk, akkor a fázis I-es klinikai vizsgálatok időtartama és költségei jelentősen megnőhetnek, míg ha túl magas ez a dózis, az biztonsági kockázatot hordoz. E kockázat elkerülését szolgálják a gyógyszerhatósági iránymutatások. Elsőként a felszívódás és a metabolizmus in vitro/in vivo korrelációját vizsgáljuk, melyhez jellemzően néhány dózis és formuláció esetén, elsősorban intravénás és orális adagolás mellett meghatározzuk a farmakokinetikai paramétereket. A vizsgálatok főbb szempontjai:

Mi a legjobb beviteli útvonal és adagolás és hogyan határozzuk meg?

Ennek a kérdésnek a megválaszolásához azt vizsgáljuk, hogy miként változik a vegyület farmakokinetikai profilja a különböző beviteli útvonalak (pl. orális, intravénás, intraperitoneális, szubkután, nazális, dermális) és adagolások (pl. hetente, naponta, naponta kétszer) mellett. Meghatározzuk azt a hatóanyagdózist az egyes beviteli út–adagolás kombinációk esetén, amivel elérhető a kívánt farmakokinetikai profil.

 

A farmakokinetikai eredmények miként befolyásolják a toxikológiai és az emberi vizsgálatok tervezését?

A toxikológiai és humán vizsgálatokat úgy kell terveznünk, hogy nagy biztonsággal el tudjuk érni a biológiai hatásossághoz szükséges farmakokinetikai jellemzőket. Az előzőekben leírt vizsgálatok alapján ki tudjuk választani azon toxikológiailag releváns fajokat (a célpont-affinitás ismert fajközi különbségei alapján), valamint a hozzájuk tartozó dózist és adagolási ütemezést, amellyel el lehet érni a hatásoshoz képest a megfelelő biztonsági faktorral megnövelt toxikológiai vérszintet.

Előfordulhat-e, hogy a gyógyszerjelöltünket más gyógyszerrel együtt adva megváltoznak a farmakokinetikai sajátságok (gyógyszer–gyógyszer kölcsönhatás)?

A gyógyszerek lebontását elsősorban a májban található, számos izoformát felsorakoztató citokróm P450 (CyP450) enzimcsalád végzi, így fontos tudnunk, hogy egy adott gyógyszerjelölt esetében mely CyP450 enzimek felelősek a lebontásáért, illetve, hogy a molekula jelenléte gátolja-e bármelyik CYP enzim működését. Jellemzően 5-6 fő CyP450 enzimen szoktuk vizsgálni a gátlási profilt és az adott CyP450 enzim részvételét a vegyületünk metabolizmusában. A CyP450-gátlás esetében vizsgáljuk annak időfüggését (TDI – time dependent inhibition) is a kovalens gátlás kiszűrésére. Amennyiben a gyógyszerjelöltünk gátolja vagy aktiválja egy olyan CyP450 enzim működését, amely egy másik gyógyszer lebontásáért elsődlegesen felel, akkor a két hatóanyag együttes adagolását lehetőleg el kell kerülni, mert az emberi szervezetben jelentősen megváltozhatnak a másik gyógyszer farmakokinetikai sajátságai.

 

Várhatunk-e toxicitást a gyógyszerjelöltünk és nemkívánatos biológiai célpontok (off-target) kölcsönhatásából?

Erre a kérdésre több úton is kereshetjük a választ. Az egyik lehetőség a gyógyszerjelöltünk és az alapvető életfunkciók szempontjából fontos fehérjék közötti kölcsönhatás vizsgálata. Több olyan fehérjepanel is elérhető, amely jellegzetes biológiai célpontokat tartalmaz (pl. Cerep biztonsági panel, kinázpanel, ioncsatorna-panel). A gyógyszerjelölt esetében vizsgáljuk, hogy mutat-e érdemi kötődést a panelben található fehérjékhez. Amennyiben igen, akkor az adott fehérje esetében meg kell állapítanunk, hogy a mellékhatás kiváltásához szükséges dózis hogyan viszonyul ahhoz a dózishoz, amelyet az eredeti hatás kiváltásához kell alkalmaznunk. Az az elvárás, hogy az elfogadható biztonságossági arányon kívül essen ez a szám.

Mutat-e a gyógyszerjelöltünk aktivitást néhány kiemelt fontosságú in vitro biztonsági tesztben?

Az évtizedek során a gyógyszerkutatók és -fejlesztők arra jöttek rá, hogy a gyógyszerjelöltek in vivo vizsgálata során néhány nemkívánatos mellékhatás viszonylag gyakran előfordul. Ilyenek például a hERG ioncsatorna gátlásából eredő szívritmusváltozás, vagy a DNS-állományra gyakorolt hatásból eredő genotoxicitás. Ezek előrejelzésére ma hatékony in vitro tesztek állnak rendelkezésre, melyeket rutinszerűen használunk a vezérmolekula optimalizálása során. A tervezett terápiás alkalmazástól függően e vizsgálatok lehetnek tájékoztató jellegűek vagy fontos kritériumok. A számszerű in vitro eredményeket általában ez esetben is a gyógyszerjelölt hatásos szabad koncentrációjával összehasonlítva tudjuk értelmezni. A leggyakrabban alkalmazott vizsgálatokat alább soroljuk fel.

Az állatokon végzett in vivo toxikológiai vizsgálatok alapján mekkora a várható különbség a legkisebb hatásos dózis és a legnagyobb tolerált dózis között ( terápiás index )?

Az in vivo toxikológiai vizsgáltokat egy rágcsáló (általában patkány) és egy nem rágcsáló fajon (általában kutya, majom, vagy disznó) szokták elvégezni. Ilyenkor több dózist is vizsgálnak; beleértve a legnagyobb tolerált dózist (Maximal Tolerated Dose – MTD). Az adagolás időtartama és gyakorisága a tervezett alkalmazási módtól függ. Az orális és az intravénás beviteli út esetén általában 7 napon át történő napi adagolás, illetve 10 napon át 2-3 naponként ismételt adagolás a bevett. A különböző dózisok esetén vizsgálják a toxikokinetikai profilt. A toxikológiai vizsgálatok során mért expozíciókat (AUC, Cmax értékeket) összevetik a főbb toxikológiai megfigyelésekkel, valamint a hatásos expozíciókkal.

Elő tudjuk-e állítani a gyógyszerjelöltet ( active pharmaceutical ingredient – API , drug substance ) a kívánt mennyiségben és tisztaságban a preklinikai és klinikai vizsgálatok támogatásához? Mennyi ideig tart várhatóan az egyes sarzsok szigorú hatósági elvárások (GMP-körülmények) melletti szintézise és milyen költségvonzata van, beleértve a só és polimorf formák vizsgálatát, a megfelelő formuláció kifejlesztését, valamint a szükséges stabilitási vizsgálatokat?

Amint azt a fentiek is mutatják, a vezérmolekula-optimalizálás szépsége és kihívása az összetettségében rejlik. Egy olyan, még feltérképezetlen területen kell előre haladnunk, ahol talán nem létezik tökéletes útvonal, viszont számos különböző megközelítés is eredményre vezethet. Ami közös a sikeres megközelítésekben, hogy az optimalizálás folyamatában nem tévesztették szem elől a legfontosabb szempontokat, és ezek esetében párhuzamosan keresték az előrelépés lehetőségét, az optimumot. Ezek alapján nem meglepő, hogy tökéletes gyógyszerjelölt nem létezik, csak több, egymásból kinövő vagy párhuzamosan kifejlesztett optimális gyógyszerjelölt, így a vezérmolekula-optimalizálás esetében annak a döntésnek a meghozása, hogy véglegesen lezárjuk a kutatási fázist, szintén kihívást jelent.