A KRAS (Kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog) a GTP-ázok családjába tartozó enzim, mely egyrészt a GTP-nek GDP-vé történő hidrolízisét katalizálja, másrészt központi jelátviteli útvonalakat aktivál. A két funkció szorosan összefügg: a GTP–KRAS/GDP–KRAS arány határozza meg az enzim aktivitását, ezáltal hatását a jelátviteli útvonalakra. A KRAS GTP-vel képzett komplexe tekinthető az enzim aktív állapotának, míg a GTP hidrolízise után visszamaradó GDP-hez kötött fehérje inaktív állapotba kerül. Az enzim aktivitását meghatározó GTP–KRAS/GDP–KRAS arányt több más enzim is befolyásolja, melyek a hidrolízist gyorsítva vagy a GDP/GTP kicserélődést katalizálva fejtik ki hatásukat. A KRAS–GTP komplex aktivál olyan „közvetítő” fehérjéket, mint például a RAF kináz, mely a MAPK és PI3K–AKT jelátviteli útvonalakat aktiválja.

 

Ebben a fejezetben az első KRASG12C-inhibitor gyógyszerekhez vezető kovalens vezérmolekulák optimalizálását tekintjük át.

 

Az adagraszib fejlesztésének kiindulópontját az Array BioPharma nevű vállalat kovalens könyvtárának a KRASG12C fehérjén történő tesztelése során azonosították. Az így talált vegyületet a fehérje röntgenszerkezetének ismeretében módosították. Ez vezetett az 1-es molekulához (5.3.1. ábra), melynek kötődési módját röntgenkrisztallográfiával bizonyították. Ez a molekula azonban a H358-sejtekkel végzett kísérletekben még az alkalmazott legnagyobb, 16 μM-os koncentrációban sem mutatott értékelhető hatást.

 

 

 

Először a 4-es vegyület in vitro farmakokinetikai paramétereit határozták meg, hogy eldöntsék, ez alapján várható-e olyan koncentráció a vérben in vivo adagolás esetén, mely elégséges lehet a várt biológiai hatás kimutatásához. A felszívódás és a sejtbe jutás megbecsüléséhez a vegyület sejtpermeabilitását MDR1-transzfektált LLC-PK1 sejteken határozták meg. A mért értékek alacsonyak voltak (Papp (A to B) = 1,4⋅10–6 cm/s és Papp (B to A) = 37⋅10–6 cm/s), és arra utaltak, hogy a sejtbe jutás alacsony szintjéért a P-gp (P-glikoprotein) transzportfehérjéknek tulajdonítható efflux, vagyis a sejtből kifelé irányuló aktív transzport a felelős (BA/AB arány = 27). Annak megbecsülésére, hogy az anyag milyen gyorsan ürül ki az egér szervezetéből, a hepatocita- és a mikroszomális klírenszt is meghatározták a megfelelő in vitro körülmények között mért adatokból. A májsejtekben mért magasabb értéket (hepatikus (máj) klírensz = 76 mL/min/kg; mikroszomális klírensz = 53 mL/min/kg) valószínűleg a fenolos hidroxilcsoporton történő fázis II metabolizmus és a májsejtek magasabb glutationkoncentrációja okozhatta (a vegyület a konjugált kettős kötéssel reagálhat). Az elfogadhatónak tekinthető klírenszértékek indokolták, hogy a 4-es vegyülettel in vivo farmakokinetikai vizsgálatokat végezzenek.

 

 

A tumornövekedés-gátló hatást MIA PaCa-2 xenograft egérmodellen (humán hasnyálmirigyrákból származó sejteket egerekbe ültetve növesztett daganat) vizsgálták. A 4-es vegyület intraperitonálisan 30 és 100 mg/kg dózisban, napi egyszeri adagolással már 5 nap után a tumor méretének csökkenését okozta, miközben az egereken sem káros mellékhatások, sem pedig súlycsökkenés nem volt megfigyelhető. Ezzel a kísérlettel a vezérmolekula hatékonysága bizonyítva lett.

 

Ha egy molekula metabolikus stabilitását növelni szeretnénk, meg kell értenünk, melyek azok a részei a molekulának, amelyek az élő szervezetben lévő lebontó enzimek hatására a leggyorsabban módosulnak. Ennek egyik legegyszerűbb módja, ha a molekulából májsejtek jelenlétében keletkező metabolitok szerkezetére LCMS-mérésekből következtetünk (5.3.3. ábra).

 

A májsejtekkel végzett kísérletek alapján a legfontosabb metabolikus átalakulás a fenol glükuronsavval történő reakciója volt, ami a metabolitok 76%-ában jelent meg. Tehát a metabolikus stabilitás növelése érdekében a naftolt egy olyan hasonló méretű csoporttal volt célszerű helyettesíteni, ami beleillik a KRASG12C lipofil zsebébe, ugyanakkor a naftolhoz hasonlóan hidrogénkötést tud létesíteni az Asp69-cel, viszont a fenollal ellentétben nem, vagy annál kisebb mértékben glükuronálódik. Az 5–9 indazolszármazékokról szerkezetük alapján feltételezhető volt, hogy megfelelnek a kritériumoknak (5.3.4. ábra, 5.3.2. táblázat). Humán májsejteken és mikroszómákon mért metabolikus stabilitásuk ígéretes is volt, közülük a 8–9-es vegyületek a 4-hez hasonló sejtes aktivitást mutattak NCI-H358 sejteken pERK inhibíciós teszten. Sajnos ezeknek a vegyületeknek viszont az effluxarányuk volt magas, mivel P-glikoprotein-szubsztrátok voltak.

 

 

 

Mivel a naftol indazollal történő helyettesítése nem vezetett eredményre, megvizsgálták a fenolcsoport eltávolításának a következményeit is. A 10-es vegyület (5.3.3. táblázat) sejtes aktivitása a fenolhoz (4-es vegyület IC50 = 142 nM) képest több mint egy nagyságrenddel csökkent (IC50 = 4400 nM), viszont a CD-1 egérben mért biológiai hasznosulása 13,9% lett, ami jelentős növekedés a fenol 2,5%-os értékéhez képest. Ezen a ponton a fent említett okok miatt, a 30-szoros sejtes aktivitáscsökkenés ellenére, nemcsak a fenolos hidroxilcsoport, de az azt aktivitás szempontjából helyettesíteni tudó NH-donor-funkciót tartalmazó heterociklusos építőelem elhagyása mellett döntöttek.

 

Az aktivitás növeléséhez azonban új kölcsönhatást kellett keresni, amihez a röntgenszerkezet alapján a piperazingyűrű szubsztitúciójával nyílt lehetőség (5.3.5. ábra, 5.3.3. táblázat). A 10-es vegyület röntgenszerkezetét megvizsgálva (5.3.6. ábra) látható, hogy egy vízmolekula létesít hidrogénkötést a Gly10 és a Thr58 aminosavakkal. A víz által elfoglalt pozíció elérhető a piperazin szénatomjairól. Az 5.3.3. táblázatban felsorolt analógok előállításának a célja ennek a vízmolekulának a kicserélése egy piperazinhoz kötött hidrofil csoport által. A stratégia sikerét mutatja, hogy a cianometil-csoporttal szubsztituált piperazin egyik enantiomere (16) esetében 300×-os növekedés volt megfigyelhető a sejtes aktivitásban. Érdemes észrevenni, hogy a másik enantiomer (17) esetén is megfigyelhető az aktivitás növekedése; ez valószínűleg a cianometil-csoport elektronvonzó hatásának köszönhető, ami növelte a molekula Michael-akceptor (karbonilcsoporttal konjugált kettős kötés) részének Cys12-kénatomjával szembeni reaktivitását.

 

 

 

A 16-os vegyület optimalizálása a naftalinváz szubsztitúciójával folytatódott. A röntgenszerkezet alapján látható, hogy a naftalin 8-as pozíciójából elérhető egy lipofil oldalláncok (Val9, Thr58, Met72, Tyr96) által kialakított kisebb kiterjedésű zseb (5.3.7. ábra a). Ennek kitöltése a kialakuló kölcsönhatások miatt jelentős affinitásnövekedést okozhat. Ez volt a célja a 19–24-es vegyületek előállításának (5.3.7. ábra b), melyek közül a 23–24-es származékok bizonyultak a legaktívabbnak, elérve az 1 nM-os sejtes IC50 értéket (5.3.4. táblázat).

 

 

A 23 és 24 vegyületek farmakokinetikáját CD-1 egérben tanulmányozták 3 mg/kg dózisban IV és 30 mg/kg dózisban PO-adagolás esetén. A 30 mg/kg orális dózis a 23-as vegyület esetén 4,2 μM maximális koncentrációt eredményezett a vérben, ami Cmaxsz = 0,21 μM-os szabad koncentrációval számolva (95%-a plazmafehérjékhez van kötve) a sejtes IC50 érték 210-szerese. A 24-es vegyületnél Cmax = 2,9 μM-t mértek, ami szabad koncentrációra átszámolva (0,14 μM) a vegyület IC50 értékének 140-szerese. Érdemes ezeket az értékeket összehasonlítani a 4-es, kiindulási vezérmolekula adataival, amely esetén már jelentős tumorgátló hatás volt megfigyelhető 30–100 mg/kg dózisban IP-adagolás esetén a molekula IC50-éhez képest kevésbé magas koncentrációban is (5.3.2. táblázat és 5.3.5. táblázat).

 

 

Az 5.3.2. táblázat és az 5.3.5. táblázat adatait összevetve látható, hogy a 23-as és a 24-es vegyületek esetében 30 mg/kg-nál PO-dózis esetén is jelentősebb in vivo hatás várható, mint a 4-es vegyület 100 mg/kg-os IP-adagolásánál.

 

A hatékonyság mellett azonban nagyon fontos szempont a biztonság, azaz annak a bizonyítása, hogy a vegyületnek nincs olyan káros mellékhatása, ami a klinikai alkalmazást kockázatossá teszi. Ennek bizonyítására különböző fajokon kell in vivo kísérleteket végezni, amihez viszont szükségesek az adott fajon előzetesen végzett farmakokinetikai vizsgálatok.

 

 

A 23-as és 24-es vegyületeket kutyán (beagle dog) vizsgálva 3 mg/kg IV- és 10 mg/kg PO-adagolással, az egéren megfigyeltnél 5–6-szor nagyobb klírenszt, két nagyságrenddel kisebb vérbeli koncentrációkat és AUC értékeket, és ezeknek megfelelően 4–8-szor kisebb biológiai hasznosulást (F%) kaptak (5.3.6. táblázat). Az egérben és a kutyában mért farmakokinetikai adatok alapján becsült humán klírensz a 23 és 24 vegyületek esetén 145 ml/min/kg és 121 ml/min/kg-nak adódott. Abból a tényből, hogy a kutyában mért klírensz és a becsült humán klírensz értékei a májban mért véráramnak (hepatic blood flow; 20–25 ml/min/kg) többszörösei (ER = extraction rate = 699% és 588%), arra lehet következtetni, hogy a vegyületek szabad koncentrációinak a csökkenésében jelentős szerepe van a nem a májban történő metabolikus átalakulásoknak.

 

A Michael-akceptor típusú kovalens inhibitorok metabolizmusát leíró irodalmi példák alapján valószínűnek tűnt, hogy a 23 és 24 jelű molekulák szervezetből való kiürülésében kulcsszerepe lehet annak, hogy a vegyületek reagálnak a szervezetben található glutationnal (GSH; 5.3.8. ábra). A reakció közvetlenül vagy a GST (glutation-S-transzferáz) enzim közreműködésével is megtörténhet. A GSH nagy koncentrációban található nemcsak a májban, de például a vérben is. Annak kiderítésére, hogy vajon a GSH-val történő reakció a szervezetben GST által katalizált-e, nagyszámú vegyület esetén meghatározták a GSH-val történő reakció sebességét jellemző felezési időket GST jelenlétében és annak hiányában, egyszerű pufferoldatban. Az adatok egyértelműen mutatták, hogy GST jelenlétében gyorsabb volt a reakció, tehát az átalakulást a GST enzim gyorsítja.

 

Meghatározták, hogy a májban a GSTA-1, a vérben pedig a GSTP-1-altípus felelős a GSH-val történő reakció katalizálásáért, és bebizonyították, hogy a májban és a vérben is a GSH-val történő, megfelelő GST-altípus által gyorsított reakció a vegyületek klírenszét leginkább meghatározó folyamat. A humán vérben mért stabilitási értékek egyértelmű összefüggést mutattak a h-GSTP-1 enzim jelenlétében meghatározott klírensszel (5.3.9. ábra). A vérben lévő GSH szerepe a vegyületek metabolizmusában összhangban van a „hepatic flow”-nál nagyobb értéket mutató becsült klírensszel. Ettől a ponttól kezdve a humán vérben mérhető stabilitás vált az elsődleges paraméterré, amivel az anyagok metabolizmusának sebességét megbecsülték.

 

 

A GSH-val történő reakció sebességére a kovalens fejhez (a GSH-val reagáló molekularész) közvetlenül kapcsolódó csoportoknak van a legnagyobb hatása, amit a 23 és a 25–28 jelű vegyületek vizsgálatával tanulmányoztak (5.3.10. ábra, 5.3.7. táblázat).

 

 

Érdemes áttekinteni az MRTX849 jelű vegyület ADME-jellemzőit (5.3.8. táblázat), hiszen ez a vegyület kiállta a klinikai vizsgálatok próbáját, és jelenleg már törzskönyvezett gyógyszerkészítmény hatóanyaga.

 

 

Az MRTX849 vegyület molekulatömege és clogP értéke a gyógyszerekre általában jellemző tartományban van (5.3.8. táblázat). Két különböző típusú sejtes teszten is aktív, IC50 értéke 4 és 14 nM, míg sejtpermeabilitása mérsékeltnek (4.7⋅10–6 cm/s), MDR-LLCPK-sejtvonalon mért effluxértéke (56) magasnak tekinthető. Májsejteken és mikroszómákon mért metabolikus stabilitása a közepes tartományba esik (ER, extraction rate) mindhárom vizsgált fajon (egér, kutya, humán). Humán vérben mért felezési ideje kimondottan hosszúnak tekinthető (t1/2 > 50h). Egér- és humán plazmafehérjékhez való kötődése magas értéket (99,0%; 98,3%) mutat.

 

A jó felbontással rendelkező röntgenszerkezetből (1,94 Å) egyértelműen látszik, hogy a vegyület kötődését meghatározó kölcsönhatások gyakorlatilag megegyeznek a kiindulási pontként szolgáló vezérmolekula és analógjai esetében megfigyeltekkel (5.3.11. ábra).

 

Kovalens inhibitorok esetében kulcsfontosságú, hogy a gyógyszerjelölt molekula nagy szelektivitást mutasson a célfehérjével szemben, tehát a szervezetben található többi fehérjével csak a lehető legkisebb mértékben lépjen kölcsönhatásba. Ahhoz, hogy a molekulának ezt a tulajdonságát megvizsgálják, az MRTX849 29-es jelű származékát állították elő. Ez a vegyület a hozzá kapcsolt etinil funkciós csoport reaktivitása miatt alkalmas arra, hogy segítségével egy fehérjekeverékből „kihalásszák” azokat a peptideket, melyek a reaktív fejjel (az akrilamid-résszel) reagálnak. Az etinilcsoportot egy flexibilis láncon keresztül a molekula pirrolidingyűrűjéhez kapcsolták, mivel ez a módosítás a röntgenszerkezet alapján várhatóan nem befolyásolja a kovalens fej reaktivitását és nem gátolja jelentősen a vegyület nem kovalens módon történő kötődését sem. A 29-es vegyület sejtes teszten mért IC50 értéke 150 nM volt, amely ugyan 1 nagyságrenddel gyengébb az MRTX849 sejtes aktivitásánál, de alkalmassá teszi a kísérlet elvégzésére. A kísérletet NCI-H358 sejtekkel elvégezve az eredmények igazolták a 29-es analóg és ebből következően az MRTX849 szelektivitását is, hiszen a 29-cel reagált KRASG12C mennyisége több mint egy nagyságrenddel meghaladta annak a többi, 468-féle fehérje szintjét, melynek mennyiségét pontosan megmérték (hiszen valamilyen mértékben reagáltak KRASG12C-vel). A többi típusú KRAS peptidhez képest is kimutatható volt 4–10 szeres szelektivitás (5.3.12. ábra).

 

A klinikai jelölt legfontosabb farmakokinetikai paramétereit egérben, patkányban és kutyában is meghatározták (5.3.9. táblázat). Az egérben és a kutyában kapott értékeket összehasonlítva a 23-as és 24-es vegyületek megfelelő adataival (5.3.6. táblázat és 5.3.7. táblázat) láthatjuk, hogy a humán vérben mért stabilitási adatokon alapuló kiválasztás elérte célját, hiszen a 25 (MRTX849) in vivo paraméterei kedvezőbbek lettek, a Cmax, az AUCinf érték és a biológiai hasznosulás is jelentősen nőtt.

 

 

A három faj esetén is 25%-ot meghaladó, egérben a 62,9%-ot is elérő biológiai hasznosulás biztató adat, ami arra utal, hogy a vegyületnek van esélye, hogy humán vizsgálatokban is elfogadható szintet érjen el. Az allometriás becslés alapján számított humán klírensz 19 ml/min/kg-nak adódott, amit ha összevetünk a 23–as és 24-es vegyületek megfelelő értékeivel (121 és 145 ml/min/kg) 6–8-szoros javulást állapíthatunk meg.

 

 

 

Az MRTX849 metabolizmusát különböző fajokból származó májsejteken is tanulmányozták. Tömegspektrometriás vizsgálatokból arra lehetett következtetni, hogy a GSH-addukt képzésének (32) és a glükuronálódásnak is kisebb szerepe van, mint az 1-es vegyület esetén (5.3.13. ábra). Ez igazolja, hogy a fenilcsoport eltávolítása az 1-es vegyületből és a kovalens fej reaktivitásának optimalizálása indokolt volt és elérte a kívánt hatást. A vegyület két legfontosabb metabolitja a pirrolidin 2-es helyzetében oxidált származék (30) és a pirrolidingyűrűn lévő metilcsoport lehasadásával keletkezett vegyület (31) volt, melyet a megfelelő referenciavegyületek független szintézisével is bizonyítottak. Az MRTX849 metabolikus profiljának érdekessége, hogy a humán májsejtek esetén jelentősen kevesebb GSH-addukt volt kimutatható, mint egér-, patkány- és kutyamájsejtek használata során (5.3.10. táblázat). Ez az eredmény jól mutatja, hogy a humán vérben mért stabilitási adatok használata a kedvező farmakokinetikájú vegyületek kiválasztására jó döntés volt.

 

 

Az MRTX849 farmakokinetikai és farmakodinamikai tulajdonságait NCI-H358 xenograft egérmodellen vizsgálták. A vegyületet orális adagolással 10, 30 és 100 mg/kg dózisban adva 6 óra elteltével meghatározták a vegyület koncentrációját a vérben és a tumorban is, továbbá megmérték, hogy a tumorban található KRAS fehérjének hány százaléka reagált az MRTX849-vegyülettel. Azt találták, hogy az MRTX849-cel kovalens kötést kialakított KRAS mennyisége egyenesen arányos a vérben mért MRTX849-koncentrációval, tehát a dózis és a szervezetben arra adott elsődleges „válasz” összefüggést mutat, ami előfeltétele a megfelelő dózis megtalálásának. A legkisebb dózis esetén az összes KRAS körülbelül 10%-a, míg a legnagyobb dózis esetén közel 90%-a reagált az MRTX849-cel.

 

A klinikai jelölt molekula tumornövekedést gátló hatását PaCa-2 xenograft egérmodellen vizsgálták orális adagolással. A vegyületet 10, 30 és 100 mg/kg-ban napi egyszeri dózist alkalmazva adagolták 16 napon keresztül (5.3.14. ábra). A tumor méretének csökkenése már a legkisebb dózis esetén is egyértelműen megfigyelhető volt, de az adagolás befejezését követően a tumor ismét növekedésnek indult. A két nagyobb dózis a tumor méretének gyors csökkenését, a negyedik nap után gyakorlatilag eltűnését eredményezte. A legnagyobb dózis esetén az egerek az adagolás befejezése után még 54 nappal is teljesen tumormentesek voltak. Testsúlycsökkenés egyik dózisnál sem volt megfigyelhető, az egerek jól tolerálták a kezelést. A kísérlet bizonyította a tumornövekedést gátló hatás dózisfüggését, és hogy a maximális hatékony dózis egerek esetében várhatóan 30 és 100 mg/kg/nap közötti érték (PO).

 

 

Érdekes és tanulságos nagy vonalakban áttekinteni és néhány ponton az adagraszib esetével összehasonlítani egy másik, az adagraszibbal azonos mechanizmussal működő kovalens KRASG12C-inhibitor, a szotoraszibhoz (ma piacon lévő hatóanyag) vezető vezérmolekula optimalizálását.

 

A szotoraszibhoz vezető optimalizálási folyamat során az egyik legnagyobb szerkezeti változás egy aromás csoport központi vázhoz való kapcsolása volt. Az ötletet egy kovalens vegyülettár KRASG12C fehérjén történő tesztelése során azonosított molekula röntgenszerkezete adta. Ezt tanulmányozva megállapítható, hogy az azonosított KRASG12C-inhibitor egyik aromás része egy olyan zsebet tölt ki, amely az ARS-1620 megfelelő (az 5.3.15. ábrán 1-essel jelölt) pozíciójából is elérhető. Először az ARS-1620 központi vázát ftalazinra cserélték, és ennek a megfelelő atomjához kapcsoltak egy új aromás gyűrűt. Az elkészült 33-as számú vegyület a KRASG12C fehérjével a vártnak megfelelően kovalens adduktot képzett, amelyről az elkészült röntgenszerkezet bizonyította a várt kötőmódot: a fenilcsoport a His95/Tyr96/Gln99 által formált kötőzsebben volt található. Ugyanakkor ez nem mutatkozott meg az aktivitás növekedésében, sőt, az IC50 érték egy nagyságrenddel csökkent ARS-1620-hoz képest. Ez arra utalt, hogy a szubsztituálatlan fenilcsoport és a fehérje között nem alakultak ki kedvező kölcsönhatások.

 

 

A fenilcsoport szubsztituenseinek optimalizálása során azonban jelentős aktivitásnövekedést sikerült elérni. A ftalazinvázat tartalmazó vegyületek közül az orto-izopropil-származék bizonyult a legaktívabbnak (34), melynek aktivitása még kedvezőbbé vált a piridazingyűrű pirimidonegységre történő cserélésével (35) (5.3.16. ábra). Az izopropil-származékokról készült röntgenkrisztallográfiás felvételek összhangban vannak azzal a feltevéssel, hogy az aktivitás növekedése az iPr-csoport és a His95/Tyr96/Gln99 aminosavak között kialakuló kölcsönhatásnak köszönhető. Az optimalizálás következő lépése a kinazolonváz piridopirimidonegységgel történő helyettesítése volt (36–38 számú vegyületek), ami két pozitív következménnyel is járt. Egyrészt növelte a vegyületek sejtpermeabilitását, másrészt a vegyület oldhatósága is kedvezőbb lett. A sejtpermeabilitás növekedése valószínűleg a fenolos hidroxilcsoport és a piridingyűrű nitrogénatomja között kialakuló intramolekuláris hidrogénkötésnek köszönhető. További aktivitásnövekedést okozott a piperazingyűrűhöz megfelelő abszolút konfigurációval kapcsolt metilcsoport (37).

 

Szintén érdemes megvizsgálni a két kutatócsoport stratégiáját a potenciálisan metabolikus instabilitást okozó fenolos hidroxilcsoporttal kapcsolatban. Az Array Biopharma és a Mirati Therapeutics kutatói az optimalizálás viszonylag korai fázisában a hidroxilcsoport eltávolítása mellett döntöttek annak ellenére, hogy ez a változtatás az aktivitást egy nagyságrenddel visszavetette. A szotoraszib esetén csak jóval később, a másik három szerkezeti elem (fenilcsoport, központi gyűrű és a piperazin) jelentős, de még nem végleges optimalizálása után tértek rá a fenolos hidroxilcsoportot tartalmazó rész változtatására. A 35-ös számú vegyület farmakokinetikai tulajdonságai még nem voltak megfelelőek az in vivo hatás eléréséhez, viszont biztató jel volt, hogy a piperazingyűrűhöz kapcsolt metilcsoporttal sikerült növelni a sejtes aktivitást és a sejtpermeabilitást. A kinazolingyűrű pirido-pirimidin-vázra történő cseréje, ami egy újabb, bázikus tulajdonságokkal rendelkező nitrogénatom megjelenésével járt, szintén kedvező hatással volt a permeabilitásra, hiszen lehetővé tette a fenolos hidroxilcsoport „elrejtését” a fenolos OH és a nitrogénatom között kialakuló intramolekuláris hidrogénkötés következtében. Ennek a nitrogénatomnak valószínűleg fontos szerepe volt abban, hogy a kifejlesztett molekula a fenolos hidroxilcsoport ellenére is gyógyszerszerű tulajdonságokkal rendelkezett.

 

 

A szotoraszib fejlesztése során egy speciális, az atropizomériából adódó problémát is meg kellett oldani a kutatóknak. A 34–37-es vegyületek esetében ugyanis a piridazin- vagy pirimidingyűrűhöz kapcsolódó fenilcsoport orto-helyzetű szubsztituense által okozott gátolt rotáció szobahőmérsékleten atropizomerek keverékét eredményezi, melynek összetétele nem kontrollálható, így nem felel meg a gyógyszerekkel szemben támasztott követelményeknek. Megoldásként a szobahőmérsékleten teljesen szabad vagy teljesen gátolt rotáció kínálkozik, esetleg az izoméria elkerülése. Habár mindhárom stratégia esetén sikerült aktív vegyületeket azonosítani, az in vivo vizsgálatok alapján 38-as molekula aktív atropizomere bizonyult a legígéretesebbnek. Amikor ezt a vegyületet 10 mg/kg dózisban orálisan adagolták, maximális szabad koncentrációja a vérben 4,5-szer volt magasabb, mint a sejtes teszten meghatározott IC50 adata. Abból a célból, hogy a vegyület várható in vivo hatékonyságát megbecsüljék, 10–100 mg/kg dózisban adagolva meghatározták a foszforilált ERK fehérje szintjét (biomarker) és azt találták, hogy már 30 mg/kg dózis alkalmazása esetén – abban az időpontban, mikor a vegyület vérkoncentrációja már csak 3 nM volt – az ERK foszforilációjának gátlása maximális mértéket ért el. Ezt összevetve a vegyület 28 nM-os IC50 értékével fontos következtetésre juthatunk, mely általában igaz a kovalens mechanizmussal működő inhibitorokra: a kovalens gátlás időben elnyúló hatást vált ki, ami akkor is fennállhat (feltéve, hogy a fehérje felezési ideje megfelelően hosszú), ha a vérben mért koncentráció már lecsökkent. Ez mindenképpen biztató jelnek tekinthető a vegyület in vivo hatékonysága szempontjából. Szintén biztató, hogy az adagolás után a biomarker szintjének időbeli csökkenésével párhuzamosan a kovalens molekulával módosított KRASG12C fehérje szintje emelkedett, ami a biomarker szintje és a KRASG12C gátlása közti kapcsolatot bizonyítja. A tumorövekedés-gátló hatás vizsgálata azt igazolta, ami a biomarkerszint alapján várható volt. 30 mg/kg dózis (amely az ERK foszforilációjának a maximális gátlását okozta) 98%-ban meggátolta a tumor növekedését legyengített immunrendszerű egerek, melyekbe MIA PaCa-2 T2 sejteket (hasnyálmirigyből származó rákos sejtvonal) ültettek, nagyobb dózis esetén pedig a tumor méretének a csökkenéséhez vezetett 2 hetes, napi egyszeri adagolás után.

 

A tumornövekedést gátló hatást bizonyító kísérletek után a kutatóknak újabb problémával kellett megküzdeni. A 38-as vegyületet kristályos formában adagolva olyan alacsony vérszintet mutatott, ami nem volt elég a kívánt hatás eléréséhez. A magyarázat az első, sikeres kísérletekben használt amorf és a későbbi, sikertelen kísérletekben használt kristályos forma különböző kinetikai oldhatóságában rejlik. Ez a gyógyszerkutatás során gyakran visszatérő probléma, ami a termodinamikai és a kinetikai oldhatóság folyamatos követésével és figyelembevételével előzhető meg. Az oldhatóság a molekula poláros felületének és hidrogénkötésre képes atomjai számának a növelésével befolyásolható kedvező irányba. Ezt a szóban forgó vegyület esetén újabb bázikus nitrogénatomok beépítésével próbálták elérni. A vezérmolekula-optimalizálási folyamata során ezt természetesen úgy kell megvalósítani, hogy közben a vegyület aktivitása ne csökkenjen jelentősen. A 38-as molekula esetében az izopropil- és metilcsoporttal szubsztituált fenilgyűrű kínál erre leginkább lehetőséget, hiszen itt az a fenilcsoport elsődleges szerepe, hogy a hozzá kapcsolt izopropilcsoport számára a megfelelő térállást biztosítsa, és ezt a szerepet heteroaromás hattagú gyűrűk is hasonlóan el tudják látni anélkül, hogy közben köztük és a fehérje között kedvezőtlen kölcsönhatás alakulna ki. A fenilgyűrű cseréje piridinre (39, 40) a várakozásnak megfelelően jelentősen növelte az oldhatóságot, de kevéssé befolyásolta a vegyületek IC50 értékét (5.3.17. ábra, 5.3.11. táblázat) A piridinszármazékok MDCK-modellen mért permeabilitása szintén jelentősen csökkent, biológiai hasznosulásuk pedig a mérhető érték alatt maradt. Egy másik megközelítés az oldhatóság növelésére a lipofilitás csökkentése. Ezt a fenti vegyületek esetén a klóratom fluorra cserélésével érték el. A 41-es számú F-származék sejtes aktivitása ugyan kismértékben csökkent a változtatás következtében, viszont sejtpermeabilitása jelentősen megnőtt. Ennek ellenére a biológiai hasznosulása a mérhető érték alatt maradt, ami valószínűleg a még mindig alacsony oldhatósággal függ össze. Végül a kétféle megközelítés egyidejű alkalmazása vezetett sikerre. A klóratom fluorra cserélése és piridingyűrű alkalmazása a fenil helyett a 42-es számú vegyületet (szotoraszib) eredményezte, melynek közepes permeabilitása, magas oldhatósága és megfelelően alacsony klírensze a többi analógét messze meghaladó biológiai hasznosuláshoz vezetett, és egyben a preklinikai fejlesztés optimalizálási szakaszának a végét jelentette.

 

 

 

A 42-es vegyület a 38-hoz hasonló, de megbízhatóbb, reprodukálható farmakodinamikai és in vivo tumornövekedés-gátló hatást mutatott, a 38-hoz képest már kisebb dózisban is. Mindezt elsősorban a molekula fizikai kémiai tulajdonságainak a módosításával érték el, amihez mindössze két atom cseréjére volt szükség.

 

Összegzésképpen kijelenthetjük, hogy a KRASG12C kovalens inhibitorok fejlesztésének példája is bizonyítja, hogy a molekula szerkezetével szorosan összefügg, abból következik, hogy a vezérmolekula optimalizálási folyamata során milyen nehézségek adódnak és ezek hogyan oldhatók meg. Ugyanakkor azt is láthattuk, hogy hasonló szerkezetből és kötődési módból kiindulva és ugyanazt a fehérjét megcélozva is különböző megoldandó problémák állnak elő, így a megoldáshoz vezető út teljesen különböző lehet. Továbbá azt is sejteti a fenti két kiragadott példa, hogy valószínűleg még sok más sikeres megoldás lehetett volna, melyek a rendelkezésre álló idő és források korlátozott volta miatt soha nem kerülnek felderítésre. Az optimalizálási folyamat során a legnagyobb kihívás: a lehető legrövidebb utat megtalálni a végtelen lehetőségek sokaságában.

 

Az adagraszibbal és a szotoraszibbal végzett vizsgálatokból sajnos kiderült, hogy a kezelés során a hatóanyaggal szemben rezisztencia alakulhat ki. A Novartis kutatói által kifejlesztett JDQ443 jelű molekulának (5.3.18. ábra), mely már a klinikai vizsgálatok fázisába lépett, az előzőleg említett vegyületektől eltér a receptorhoz való kötődési módja. Ez hozzájárulhat ahhoz, hogy az adagraszibbal és szotoraszibbal szemben már rezisztens betegeknél is hatékony legyen.

 

 

Az AstraZeneca által fejlesztett, agyi metasztázisok kezelését is megcélzó AZD4747 jelű molekuláról biztató adatokat közöltek. Habár az agy-vér gáton történő átjutás fajspecifikus jelleget mutat, a majmokon végzett kísérletek kielégítő agyi penetrációt jeleztek.