Ezt az anyagot a 60-as években sikerült először tisztán izolálni (Brown és mtsai, 1969), és így felfedezni a ma ismert két fő inkretin hormon egyikét, a glükózdependens inzulinotrop polipeptidet (GIP). A másik fő komponenst, a glukagonszerű peptid-1-et (GLP-1) majdnem 15 évvel később Graham Bell írta le (Bell és mtsai, 1983). A GLP-1, mint arra hamarosan fény derült, igen fontos szerepet játszik az anyagcserében, különösen a vércukorszint és az étvágy szabályozásában. Egészséges emberekben GLP-1-peptid-kiválasztás történik azonnal az evés megkezdését követően, ami csökkenti a vércukorszintet az inzulinkiválasztás növelésén és a glukagonkiválasztás egyidejű csökkentésén keresztül. A GLP-1 peptid emellett lassítja a gyomor kiürülését, és hatással van az agy étvágy-szabályozására is, csökkentve az éhségérzetet és növelve a teltség érzetét. A természetes GLP-1 peptid azonban gyorsan, mintegy 2 perces felezési idővel lebomlik a dipeptidil-peptidáz-4 (DPP-4) enzim hatására, amely a (GLP-1 számozás szerinti) Ala8–Glu9 kötést hasítja.

A fentiek alapján nyilvánvaló, hogy kívánatos lenne olyan gyógyszermolekula kifejlesztése, amely a szervezetben – szükség esetén – a GLP-1 (és/vagy a GIP) koncentrációját megfelelő, terápiás kezelés céljára is alkalmas szinten tartja. Erre elvileg több lehetőség is kínálkozik. Az első ilyen megközelítés a DPP-4-inhibitorok fejlesztése volt, amelyek adagolásával a természetes úton kiválasztott GLP-1 peptid hatását lehet meghosszabbítani. Számos ilyen hatású molekula forgalomba is került [vidagliptin (Villhauer és mtsai, 2003), szaxagliptin (Augeri és mtsai, 2005), szitagliptin (Drucker és mtsai, 2007) stb.], azonban az a GLP-1-szint, amit ezek segítségével el lehetett érni, csak kevéssel volt a természetes tartomány felett. Ennek ellenére a vércukorszint-csökkentő hatásuk jelentősnek és klinikailag relevánsnak bizonyult, ugyanakkor a terápia így nem vezetett a testsúly jelentős csökkenéséhez sem a preklinikai, sem a klinikai vizsgálatok során. Egy másik, logikusan kínálkozó lehetőség a természetes GLP-1 szintetikusan előállított azonos peptiddel való pótlása lehetne: azonban a GLP-1 még intravénás adagolás esetén is kevesebb mint két perces felezési idővel elbomlik (Villhauer és mtsai, 2003). A harmadik, és végül kétségtelenül a legsikeresebbnek bizonyult megközelítés a GLP-1 biológiai hatását utánzó, GLP-1-receptor-agonista hatású molekulák keresése volt. A gyógyszerkémiában különösen érdekes fejezet a GLP-1-receptor-agonisták kutatása, elsősorban azért, mert ebben az indikációban peptidmolekulák voltak és vannak a főszerepben: magát a GLP-1-t – mint vezérmolekulát – több vállalat is eredményesen optimalizálta, melynek eredményeképp napjainkban 11 ilyen továbbfejlesztett analóg van forgalomban és további több tucat peptidanalóg van jelenleg is a klinikai fejlesztés utolsó fázisaiban. Ennek a fejezetnek az első része a peptidalapú GLP-1-mimetikumok fejlődését mutatja be egy kiragadott példán keresztül részleteiben is. A fejezet második részében rövid áttekintés található a kismolekulás GLP-1-receptor-agonistákról, amelyek jelentős lemaradásban vannak a peptidanalógokhoz képest, de a GLP-1-receptor szerkezetének felderítésével egyre több ígéretes molekulacsalád lát napvilágot.

Mindezek ellenére ma már számos GLP-1-agonista peptid hosszabb ideje jelen van a piacon, amelyeket eleinte elsősorban a 2-es típusú cukorbetegség kezelésére használtak sikeresen, de ma már a legsikeresebben módosított GLP-1-analógokat legnagyobb mennyiségben elhízás csökkentésére írják fel.

Az exenatid (Byetta) volt az első ilyen forgalomba került molekula 2005-ben. Ez egy olyan „nem humán” GLP-1-peptid-analóg (mindössze 53% homológiával), amelyet eredetileg egy, a mexikói Sonora sivatagban élő mérges gyíkfajta (Heloderma suspectum, „Gila monster”) nyálából izoláltak (Malhotra és mtsai, 1992). Intravénás (i.v.) beadás esetén ugyan csak 30 perces felezési ideje van, de szubkután (s.c.) injektálás esetén 2–3 órás felezési idővel rendelkezik (5.4.1. ábra). Ez a terápiás kezelés szempontjából már értelmezhető, de ez még így is legalább napi két injekciót jelent (Linnebjerg és mtsai, 2007). A megnövekedett stabilitás a DPP-4 enzimmel szembeni nagyobb ellenálló képesség következménye, ami annak köszönhető, hogy a peptid hetes pozíciójában a szokásos alanin helyett egy glicin található. Ez olyan kulcsmegfigyelésnek bizonyult, amely a későbbi peptid hatóanyagok fejlesztése során szinte kivétel nélkül valamilyen formában felhasználásra került. Mondhatni, hogy a vezérmolekula-optimalizálás első lépését maga a természet végezte el.

Ezt követte időrendi sorrendben a liraglutid (Victoza) piacra kerülése 2009-ben (5.4.1. ábra), amelynek már hosszabb a felezési ideje (i.v. 8–10 h, s.c. 12–13 h), és így a napi egyszeri adagolást is kellően hatékonnyá tette (Knudsen és mtsai, 2000). Ezt úgy érték el a Novo Nordisk kutatói, hogy a humán GLP-1 közeli analógjának módosított peptidláncához egy zsírsavat kapcsoltak egy távolságtartó molekularészlet (spacer) segítségével (Madsen és mtsai, 2007). Ezzel a vezérmolekula-optimalizálás következő, a későbbi történéseket alapvetően meghatározó lépését tették meg: ez a módosítás az albuminkötődés szándékos megnövelésére irányult, amelynek fontos következményei lettek. Az albumin a leggyakoribb fehérje a plazmában, és közismert, hogy sok gyógyszerhez képes kötődni. Gyakran ezt a kötődést nemkívánatosnak tartják, mivel korlátozhatja a gyógyszer hatékonyságát a kialakuló alacsony szabad gyógyszerfrakció miatt. Ez a jelenség azonban kívánatos is lehet, mivel az albuminhoz való kötödés növelheti a kérdéses hatóanyag stabilitását a májban, és így meghosszabbítja a terápiás hatást. A kutatók egy optimalizálási körben megállapították, hogy hosszú láncú zsírsavak a GLP-1 molekulán különböző helyekre kapcsolhatók anélkül, hogy a hatékonyság jelentősen csökkenne a humán GLP-1-receptorral szemben. A zsírsavláncok végleges helyét a lánc C-terminálisa közelében jelölték ki, a lehető legtávolabb attól az N-terminális régiótól, amelyet korábbi tanulmányok már fontosnak találtak a receptoraffinitás és -aktiváció szempontjából. Több hatékony vegyületet is azonosítottak, amelyek plazmafelezési ideje meghaladta a 10 órát, így alkalmasak voltak a napi egyszeri adagolásra. Ezek közül a vegyületek közül azt választották klinikai fejlesztésre, amelyben a zsírsav egy „spacer”-rel kapcsolódott a lizin-oldallánc ε-amino-csoportja és a zsírsav karboxilcsoportja közé, és amely liraglutid néven került forgalomba.

A GLP-1-receptor-agonisták következő optimalizálási mérföldköve az albiglutid (Tanzeum, Eperzan) volt, amit a GlaxoSmithKline (GSK) fejlesztett ki és hozott forgalomba 2014-ben (Young és mtsai, 2014). Ez már két GLP-1-analóg peptidből áll, amelyeket elsőként C- és N-terminálisukon keresztül összekötöttek, majd az így kapott dimert egy humán albuminmolekulához kapcsolták, annak is az N-terminális végén (5.4.1. ábra). Mindkét GLP-1-részt a 7-es pozícióban az exenatidnál korábban hasznosnak talált alanin–glicin cserével módosították. Ez a szerkezet még hosszabb felezés időt biztosít, mivel az albuminhoz való direkt kötődés tovább lassítja a peptid lebomlását. A maximális plazmakoncentráció így 2–4 napig mutatható ki, míg maga a felezési idő 6–8 nap körül van. Ezt a terméket azonban 2018-ban gazdasági okokból visszavonták a piacról.

Az abiglutiddal szinte egy időben, csak néhány hónappal később került piacra az Eli Lilly GLP-1-agonistája, a dilaglutid (Aplevant, Trulicity), amely szintén kellően stabil ahhoz, hogy elég legyen egy héten egyszer beadni a betegeknek. A Dilaglutide szerkezete egy olyan módosított GLP-1-analógot tartalmaz két példányban, amelyek a humán immunglobulin G4 (IgG4) fehérje Fc-részletéhez kapcsolódnak. A glukagonszerű peptid-1 ezúttal a már jól ismert alanin–glicin csere mellett két további aminosav-módosítást hordoz.

A szemaglutid felfedezésére irányuló kutatások a liraglutidot használták fel kiindulópontként (Lau és mtsai, 2015).

A Novo Nordisk tervezési stratégiája elsősorban a liraglutid „oldalláncának” módosításával előállítható molekulákra fókuszált, megcélozva egy részletes szerkezet–hatás vizsgálatot in vitro humán GLP-1 receptorkötődési affinitására. A receptorkötődésen túl egy in vitro funkcionális vizsgálatot is használtak, hogy megbecsüljék a különböző GLP-1-analógok agonista hatáserősségét. Az egyik fontos tervezési kritérium az volt, hogy az előállítandó új analógokat szerkezetileg minél inkább hasonlóvá tegyék a természetes GLP-1-hez, és ne vezessenek be szükségtelen aminosav-változtatásokat azért, hogy elkerüljék az exenatid és a taszpoglutid esetében is tapasztalt káros immunválaszokat. Ez utóbbi egy több ponton is módosított GLP-1-analóg, még 2003-ban szabadalmaztatta a Roche és az Ipsen, de a fejlesztési programokat az ígéretes hatás ellenére klinika 3 fázisban le kellett állítani. Az exenatid esetében is jelentős számú betegnél alakul ki antitesttermelés, de ez nem befolyásolja annak biztonságosságát (Chen és mtsai, 2024).

Az első eredmények azt mutatták, hogy az albumin nélkül mért GLP-1-receptor-affinitást általában csak csekély mértékben befolyásolta egy albuminkötődést elősegítő csoport (protraktor) kapcsolása a GLP-1 bármely lizin-oldalláncához (a 16, 22, 26, 37 vagy a 38 pozícióban), és a legtöbb ilyen származék kötődési IC50 értéke 0,5 nM alatt volt.

A farmakokinetikai profil, azon belül is a szisztémás felezési idő további javítása érdekében célul tűzték ki az albuminhoz való kötődés megnövelését. Az albuminkötődés növelésének egyik fő kockázata, ahogy az közismert, abban van, hogy a szabad frakció jelentősen lecsökkenhet, ami a hatékonyság romlásához és ezáltal a kívánt hatás eléréséhez szükséges dózis megnövekedéséhez vezethet. E két ellentétes hatás alapján reális aggodalom volt, hogy lehetséges-e megfelelő albumin kötődést elérni elég nagy receptoraffinitással kombinálva. A zsírsavak hosszának és lipofilitásának növekedésével járó negatív hatást a kezdeti kísérletek során itt is megfigyelték. Így például a liraglutid és annak C18 zsírsavanalógja esetében, valamint a 3-as és 4-es vegyület esetében a zsírsav láncának hosszát C16-ról C18-ra növelve csökkenés mutatkozott a mért hatékonyságban.

Ezen a ponton komoly kihívásnak tűnt, és kétséges volt, hogy lehet-e egyáltalán olyan analógot tervezni, amely alacsony dózisban is hatékony, de mindeközben reverzibilisen és megfelelő mértékben kötődik az albuminhoz, a szisztémás kiürülés meghosszabbításához. A szisztematikus vizsgálatok első lépéseként egy sor, a Lys26 ε-amino-csoportján módosított Aib8, Arg34 GLP-1- (7−37) analógot állítottak elő, hogy megvizsgálják, mennyire befolyásolhatja a hatékonyságot és a receptorkötődést valamilyen linker- (pl. γGlu) motívum beépítése a peptid és a C16 zsírsav közé. Az előállított származékoknál a legnagyobb, 23-szoros affinitáskülönbséget 2% albumin jelenlétében a γGlu-linkert tartalmazó 5-s és a γGlu-3xOEG-linkert tartalmazó 7-es származék között mértek. Ennek a párnak a funkcionális hatékonyságában csak négy-ötszörös különbség volt. Jól megfigyelhető általános tendencia volt a GLP-1 receptorkötődés javulása albumin jelenlétében a linker lánchosszának növelésével. Ugyanakkor az alacsony és a magas albuminszint mellett mért kötődés aránya a linker hosszának a növelésével a legtöbbször csökkent.

Azért, hogy jobb albuminkötődéssel bíró molekulát állítsanak elő, mint a liraglutid volt, a C16 zsírsavat egy sor lipofil csoporttal cserélték le. A korábbi ismeretek alapján várható volt, hogy mind a lipofilitás növekedése, mind a savas csoport elhelyezkedése hatással lesz a zsírsavak albuminnal való kölcsönhatására.

Vizsgálták az előállított vegyületek GLP-1-receptor-affinitását albumin távollétében, ahol az albuminkötődéssel való versengés nem befolyásolta az eredményeket. Mindeközben számos kísérletet tettek az albuminhoz való kötődés mérésére is, de nem sikerült megbízható vizsgálati módszert találni, aminek feltételezett oka a peptidanalógok különböző felületekhez való magas, nem specifikus tapadása. Az albumin jelenlétének a GLP-1-receptor-kötődésre való hatását úgy vizsgálták, hogy a kötődési dózis–válasz görbének az eltolódását számszerűsítették. Így az albuminaffinitás helyettesítőjeként bevezették az IC50 (2% albumin)/IC50 (0% albumin) arányt, amire „BR” (binding ratio) arányként hivatkoztak a későbbiekben (5.4.1. táblázat). Ez végeredményben pragmatikus szűrési tervnek bizonyult az in vivo farmakokinetikai vizsgálatokhoz való jelöltek kiválasztásra.

A zsírsav hosszának növelése C16-ról C18-ra enyhén negatív hatással volt mind a hatékonyságra, mind a kötődésre albumin hiányában az Arg34 GLP-1 peptiden, azonban megfigyelhető volt, hogy 2% albumin jelenlétében a kötődés javult C16-ról C18-ra váltva. Fontos megfigyelés volt továbbá az, hogy az Aib8, Arg34 GLP-1 sorozatban a GLP-1-receptor-kötődés albuminnal és albumin nélkül is jelentősen javult, ha a C16-ról C18 zsírsavra váltottak és ezt a γGlu-2xOEG-linkerrel kombinálták (vö. 6 és 8). Ez az eredmény mutatott rá igazán először a használt linker fontosságára. Számos további, megnövelt zsírsavlánc-hosszúságú és különböző linkert tartalmazó analógot készítettek, de jelentős javulást már nem tapasztaltak.

A liraglutid eredeti tervezése során a γGlu-linkert azért vezették be, hogy azzal kompenzálják a palmitát savas csoportjának elvesztését, amelyet az amidkötéshez használtak. Annak érdekében, hogy értelmezzék az albuminkötődésért felelős oldalláncban levő savfunkció elhelyezkedésének hatását, az albuminkötődésre több olyan származékot is előállítottak, amelyek terminális karbonsavat tartalmaztak. Az első néhány analógot C16 dikarbonsav felhasználásával állították elő, különböző hosszúságú linkerekkel kapcsolva a peptidlánchoz. Ahogy az 5.4.1. táblázatban is látható, a terminális sav hozzáadása erős negatív hatással volt a hatékonyságra és a kötődésre is, körülbelül tízszeres csökkenést mutatva az affinitásban 12 esetben a 6-hoz képest. A vizsgálatokban az is látszott, hogy a zsírsavat a peptiddel összekötő linker felépítése jelentős hatással van a hatékonyságra. Ezen eredmények hatására a kutatók elhatározták, hogy átfogó szintetikus kampányt indítanak a jó kötődés mellett a legjobb BR- és hatásértékekkel rendelkező linker/zsírsav kombináció azonosítására az Aib8, Arg34 GLP-1 sorozatban.

A legérdekesebb eredményeket a γGlu-2xOEG linker esetén kapták, ahol a C16 disavról (12) C18 disavra változtatva (15) az albuminkötő részt a BR-érték drámai módon, több mint negyvenszeresére, 940-re növekedett jelezve, hogy ez a molekula esélyes lehet a későbbi kiválasztásra.

Nem javult tovább a BR-arány a zsírsav hosszának további növelésére C20 disavra (16), illetve C22 disavra (17). Ezeknek az analógoknak a receptoraffinitása HSA nélkül összemérhető volt a 15-ével, míg 2% HSA jelenlétében nagyon sokat javult a 15-éhez képest. Ennek a sorozatnak egyik fontos megfigyelése, hogy a C12 disav felől a C22 disav irányába haladva a zsírsav láncának növekedésével az in vitro hatékonyság előszőr fokozatosan javul a C12 disavtól (9, 42,5 pM) a C18 disavig (15, 6,2 pM), majd ismét csökkent (lásd 16 és 17). Ezek alapján le lehetett vonni a következtést, hogy a C18 disav lehet az optimális választás az in vitro hatékonyság szempontjából.

Már a projekt kezdeti stádiumában megállapították, hogy a GLP-1 peptid acilezése több pozícióban is lehetséges anélkül, hogy a molekula elveszítené a receptorhoz való affinitását. A vezérmolekula-optimalizálás utolsónak tekinthető fázisában úgy döntöttek a kutatók, hogy megvizsgálják, hogyan befolyásolja az acilezés helyzete a vizsgált in vitro tulajdonságokat. Egy viszonylag összetett megközelítéssel – nem részletezett elvek alapján – nemcsak a linkert, hanem a kapcsolódási pontot és a peptidlánc néhány aminosavját is szisztematikusan változtatták, egyedül a C18 disav szerkezeti elem volt állandó (5.4.2. táblázat). Ezen GLP-1-származékok közül négy peptid EC50 hatékonysági értéke volt 10 nM alatt (19, 20, 21 és 22), kombinálva 0,5 nM alatti receptoraffinitással. A BR-arány minden esetben viszonylag alacsony volt, és mindössze négy származék esetében ért el 100 feletti értéket (18, 21, 22 és 23).

A natív GLP-1-et a DPP-4 gyorsan hasítja, míg az albuminhoz erősebben kötődő liraglutid lebomlásának sebessége már kisebb az Ala8–Glu9 pozícióban. Amint a 5.4.4. ábra is jól mutatja, a 8-as helyzetben Aib8-t tartalmazó 15 már hosszabb szisztémás felezési idővel rendelkezik, mint az Ala8-at tartalmazó 23-as analóg. Valójában a 23-as analóg in vivo stabilitása nagyon hasonló a liraglutidéhoz, ami arra utal, hogy nemcsak a 15 liraglutidhoz képest erősebb albuminkötődése fontos, hanem a DPP-4-gyel szembeni megnövekedett stabilitás is szükséges a hosszú szisztémás felezési idő eléréséhez.

A potenciális immunogenitási válaszok kockázatának korlátozásának érdekében mindenképpen olyan peptidet kerestek, amely szerkezetileg hasonló a liraglutidhoz és a natív GLP-1-hez is. Így a lehetséges jelöltek közül a 15 felelt meg a legjobban ezeknek a szerkezeti prioritásoknak, és mivel előnyös farmakokinetikai profillal rendelkezett, kombinálva az elfogadható receptorhatékonysággal, ezt a molekulát választották ki klinikai fejlesztésre, és ez került végül forgalomba szemaglutid néven (Lau és mtsai, 2015).

Ez egy olyan innovatív technológia, amelyet az Emisphere Technologies fejlesztett ki, és amely szintetikus, nem acilált aminosavak hordozóként való használatán alapul, a természetes passzív transzcelluláris GI-transzportot kihasználva. A gyakorlatban ez azt jelentette, hogy a szemaglutidot nátrium-N-(8-[2-hidroxi-benzoil]amino)-kapriláttal (SNAC, 5.4.5. ábra) kombinálták (10 mg peptid + 300 mg SNAC), ami elősegíti a hatóanyag felszívódását azáltal, hogy transzcellulárisan hat a gyomor nyálkahártyájára egy lokális pH-emelkedés révén (Antza és mtsai, 2019).

A szemaglutid szájon át adható formáját az FDA és az EMA 2019-ben, illetve 2020-ban jóváhagyta a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő felnőtt betegek glikémiás kontrolljának javítására. Fontos megjegyezni, hogy ennek a több módon is módosított peptidanalógnak a biohasznosulása is csak 0,7–1,4% között volt mérhető a klinikai vizsgálatok során (Overgaard és mtsai, 2021), ami messze elmarad a „klasszikus” kismolekulás hatóanyagoknál megszokott és elvárt értékektől.

A GLP-1-receptor nem peptidagonistáinak (NPA) megtalálása komoly kihívást jelentett, mivel nehéz olyan ligandokat felfedezni, amelyek bár nem peptid jellegűek, de képesek utánozni a természetes GLP-1 peptid farmakológiai tulajdonságait. Ezeket a vegyületeket úgy kell optimalizálni, hogy képesek legyenek indukálni a receptor aktív konformációjának kialakulását. Szerkezeti biológiai vizsgálatokból ismert, hogy a GLP-1-receptor aktiválása GLP-1 által mind poláris, mind apoláris kölcsönhatásokat használ a receptor több mint 50 aminosavával egy időben. Ez általános más peptidligandok esetében is, amelyek legalább 3000 dalton méretűek, ezért nem könnyű elképzelni kisebb, nem peptidligandokat, amelyek értelemszerűen kevesebb receptorérintkezést hozhatnak létre, és mégis képesek megismételni a peptidagonista hatását.

A GLP-1-receptor – mint a legtöbb GPCR – aktivitása is közvetetten szabályozható allosztérikus modulátorok által. Az allosztérikus modulátorok nem a természetes szubsztrát ún. ortosztérikus kötőhelyéhez kapcsolódnak, hanem a receptor egy másik, ún. allosztérikus kötőhelyén fejtik ki hatásukat (Liu & Nussinov, 2016). Az allosztérikus modulátorokat a receptor aktivitására gyakorolt hatásuk alapján pozitív, negatív vagy semleges kategóriákba sorolják. A pozitív allosztérikus modulátorok (PAM-ok) növelik a természetes agonista kötődési affinitását és/vagy hatékonyságát a receptorral szemben. Olyan alacsony molekulatömegű vegyületek kifejlesztése, amelyek GPCR-ok allosztérikus kötőhelyeit célozzák meg, már klinikailag is sikeres volt (Dorr és mtsai, 2005; Harrington és mtsa, 2007). Ezért izgalmas lehetőségként vetődött fel a GLP-1-receptoron ható PAM-ok kifejlesztése. E megközelítésnek számos potenciális előnye van. Általánosságban elmondható, hogy az allosztérikus kötőhelyek kevésbé konzerváltak, mint az ortosztérikus kötőhelyek, és ezek támadása jobb altípus-szelektivitást és csökkentett mellékhatásokat eredményezhet (Lazareno és mtsai, 2004). Ezek a PAM-ok bizonyítottan szelektíven aktiválnak egyes jelátviteli útvonalakat másokkal szemben, így a kívánt funkcionális szelektivitást és új hatékonysági módokat biztosíthatnak (Pupo és mtsai, 2016). Végül, de nem utolsósorban, az allosztérikus ligandumok fokozhatják a rossz biológiai hozzáférhetőséggel rendelkező ortosztérikus ligandumok hatékonyságát is.

Legelsőként a Novo Nordisk még 2000-ben szabadalmaztatott egy sor kismolekulát, amelyeket ago-allosztérikus modulátoroknak neveztek el (Knudsen és mtsai, 2007). Ezek a vegyületek egyszerre allosztérikus aktivátorként és független agonistaként is hatnak a GLP-1-receptorra. A legpotensebb azonosított vegyület glükózfüggő inzulinfelszabadulást stimulált in vivo kísérletekben, de GLP-1-receptor-knockout egerekből nem.

Miután 500 000 vegyület kompetitív kötődési vizsgálata nem adott egyetlen tisztán agonistaként jellemezhető, specifikus kötődésű találatot sem, a kiindulópontot funkcionális vizsgálatok segítségével kezdték keresni. Ennek költsége és komplexitása azonban csak 250 000 vegyület szűrését tette lehetővé, melyből egy kinoxalinvázas, igazoltan hGLP-1-agonista sajátságú vegyületsorozatot azonosítottak. A kezdeti optimalizálás a 24-et eredményezte, amely kellően szelektív és potens volt, azonban nagy meglepetésre a radioligand-kötődési kísérletben nem szorította ki a GLP-1-t, sőt kötödését követően tovább fokozta a peptid receptorhoz való affinitását, méghozzá koncentrációfüggő módon.

A 24 vezérmolekula optimalizálása a 25-t eredményezte (EC50 101 nM), és további számos analóg mutatott 2–300 nM közötti aktivitást (5.4.6. ábra). Érdekes módon a leghatékonyabb molekulák dózis–hatás görbéje harang alakúnak mutatkozott, ami nem a korlátozott oldhatóság következménye volt, hanem nem specifikus antagonista hatást jelzett, amely a molekulacsalád további fejlesztését megakasztotta. A felfedezés jelentőségét az adta, hogy ez volt a GLP-1-receptor első leírt kismolekulás nem peptid agonistája, jól használható referenciamolekulát adva a további kutatásokhoz. A kezdeti eredményeken felbuzdulva több csoport is megpróbálta a kinoxalinok továbbfejlesztését. Nagyszámú 2-tio-helyettesített kinoxalint írtak le gyenge GLP-1-receptor-agonistaként. Ezek közül a legígéretesebb a DA-15864 jelű származék volt (Moon és mtsai, 2011), amely szelektíven stimulálja az emberi GLP-1-receptort 163 nM-os EC50 értékkel, és növeli az intracelluláris cAMP-szinteket.

 

A Pfizernél is sokat és hosszú ideig kísérleteztek, mire sikerült olyan nagy áteresztőképességű szűrési (HTS) módszert kifejleszteniük, amely a gyenge agonista molekulák felismerésére is képes volt (Griffith és mtsai, 2022). Ehhez egy korábban már ismert PAM-molekulát, a BETP-t használták, ami az aktivációs energiagát csökkentésével hatékonyan javította a felhasznált sejtalapú funkcionális esszé érzékenységét.

A BETP használatával a GLP-1-receptor által közvetített cAMP jelátviteli út felerősödése volt megfigyelhető, így például a pozitív kontrollként alkalmazott, gyenge nem peptid GLP-1-receptor-agonista, a Boc-528 is értékelhető, pozitív választ adott. A tervezett HTS szempontjából fontos volt az a tény, hogy ebben a kísérleti összeállításban a mérhető maximális hatás (Emax) erősödött fel leginkább, ami egypontos (egy koncentrációnál végzett) mérések során kifejezetten előnyös.

A BETP-érzékenyített cAMP-alapú szűrés (SA + BETP) így kitűnően adaptálható volt egypontos formátumra, és 2,8 millió, a Pfizer vegyületgyűjteményéből származó molekulát teszteltek rajta. Egy vegyületet akkor tekintettek találatnak, ha a megfigyelt hatás meghaladta a 30%-ot (azaz a GLP-1 Emax értékének 30%-át) 10 μM-os koncentrációban. Ez a kritérium alacsonynak mondható, 0,013%-os találati arányt eredményezett. A találatok között több pirimidinszármazék is volt, amelyek közül a 26 jelölésű vegyületet választották kiindulópontnak (5.4.8. ábra).

Fontos, hogy a 26-os vegyület inaktív volt GLP-1-receptor-agonistaként a BETP-t nem tartalmazó, nem érzékenyített cAMP SA-tesztben, míg a BETP jelenlétében kb. 70%-os hatást mutatott. Ez kockázatos szűrési stratégiának tekinthető, mert fennállt a lehetőség, hogy az így azonosított GLP-1-receptor-agonista vezérmolekula-sorozat aktivitása továbbra is függhet a BETP jelenlététől, és eleinte nem is volt világos, hogy megfigyelhető lesz-e a GLP-1-receptor-agonizmus BETP nélkül. A vizsgált gyenge agonisták hatását ez a módszer a gyakorlatban mintegy százszorosára erősítette, azonban ez a pozitív hatás az aktivitás javulásával csökkent, és a 100 nM-os aktivitású vegyületek esetében már teljesen eltűnt.

A vezérmolekula-sorozat (lead series) optimalizálása során az elsődleges szempont az volt, hogy javítsanak a GLP-1-receptor aktiválásán, elsősorban hatékony poláris kölcsönhatás kialakítására képes csoportok megfelelő helyre történő elhelyezésével, lehetőleg minimális molekulatömeg-növekedés mellett. A fő kihívás olyan molekula azonosítása volt, melynek oldatbeli konformációja a lehető legjobban hasonlít a receptorhoz kötött konformációjához.

A kiválasztott vezérmolekulán négy szerkezeti rész került megkülönböztetésre, melyek lényegesnek tűntek a vezérmolekula-optimalizálás szempontjából: a) a benziléter, b) az 5-fluoropirimidin c) a piperidingyűrű, d) a benzimidazol (5.4.8. ábra).

A piridin módosítása és kombinálása a polárosabb 6-aza-benzimidazollal a 27-es vegyülethez vezetett (EC50 = 77 nM SA + BETP-ben, 5.4.9. ábra, 5.4.3. táblázat), amely már több mint 100-szor hatékonyabb volt, mint a kezdeti HTS-találat (26), és így már aktív volt BETP-érzékenyítés nélküli tesztben is (SA EC50 = 2600 nM).

A megfelelő szerkezeti információ hiányában a karbonsav funkciós csoportot is tartalmazó új molekulák tervezését a nagyszámú molekula szintéziséből megállapítható SAR és az a megfigyelés vezérelte, hogy a polaritás jobban tolerált a benzimidazol-régióban. Végül a karbonsavat is tartalmazó szubsztituens a benzimidazol 7-es pozíciójában bizonyult előnyösnek, így ez az optimalizálási kör a 28-as vegyületet eredményezte.

A 28-as karbonsav hatékonysága összehasonlítható volt a 27-es vegyületével [EC50 = 4,6 μM], de a változtatásoknak köszönhetően már jelentősen alacsonyabb lipofilitással rendelkezett (logD7.4 = 2,3). További optimalizálás eredményeképpen még az is kiderült, hogy a hatékonyságot a karbonsavnak a benzimidazol 6-os pozíciójához csatolásával lehet elérni (29). Ennek a vegyületnek a metabolikus stabilitása és hERG-profilja is sokkal jobb volt.

 

A legjobbnak bizonyuló vegyület egy metiléncsoporton keresztül kapcsolt oxetángyűrűt hordozott, ami két nagyságrenddel növelte a hatékonyságot a metilcsoportot hordozó analóg 29-es molekulához képest. Ez a vegyület, ami danuglipron (PF-06882961) néven került fejlesztésbe, teljes agonista hatást mutatott (EC50 = 13 nM) a CS cAMP-tesztben. A danuglipron az új benzimidazol-szubsztiutens mellett egy nitril-helyettesítőt tartalmaz a benzil-éter-régióban lévő klór helyett.

Nem sokat tudni arról az útról, ami a danuglipron előtt – de nyilvánvalóan ugyanebből a vezérmolekula-optimalizálási kampányból kikerült – fázis II vizsgálatokig jutó és ott májtoxicitás (kórosan megemelkedett transzamináz-szint) miatt leállított lotiglipronhoz (PF-07081532) vezetett (Amin és mtsai, 2025). A benzil-éter-régióban található meglehetősen komplex molekularészlet jelzi, hogy a vezérmolekula-optimalizálás során nagyszámú és komoly diverzitással rendelkező vegyületkönyvtárat állíthattak elő.

A danuglipron 2021 januárja óta fázis II vizsgálati stádiumban van elsősorban nem diabetikus elhízott felnőttek kezelésére, és eddig a lotiglipron leállításához vezető mellékhatásról szerencsére nem érkezett jelzés (Saxena és mtsai, 2021).

A danuglipron szerkezetének ismertté válása után a versenytársak egymás után szabadalmaztatták az originátor által nem védett, továbboptimalizált analógokat. Ezen új molekuláknál a danuglipron mint vezérmolekula továbboptimalizálásának eredménye, megfelelő adatok hiányában nem értékelhető. Nem tudjuk eldönteni, hogy a szabadalmilag védett kémiai térből való kikerülésen túl sikerült-e javítaniuk a danuglipron hatékonyságán. A szerkezeti változtatások (5.4.10. ábra) önmagukért beszélnek, és kijelölnek egyfajta fejlődési utat. A meghatározó szerkezeti elemek, mint a királis oxetán, a benzil-éter vagy a központi piridingyűrű változatlan maradt, és a Pfizer által optimálisnak tartott piperidin-linkeren történt a legtöbbször változtatás. A karbonsav funkcióscsoportot általában megőrizték, bár egy példában [1,2,4]triazol heterociklus került a helyére bioizoszterként.

Terápiás szempontból a kismolekulás GLP-1-receptor-agonisták elvitathatatlan előnye az orális adagolás lehetősége az egyértelműen jobb orális biohasznosulásuk és alacsonyabb molekulatömegük miatt, ellentétben a natív GLP-1-gyel és analógjaival. A GLP-1 peptid és a kismolekulás agonisták GLP-1-receptorhoz kötődésének a krio-EM -zerkezeteik egymásra vetítésével jól látható, hogy ezek a hatóanyagok a GLP-1 peptidnek csak a 10-től 21-ig terjedő aminosavaival vannak átfedésben. A nem peptid kismolekulák farmakológiailag egyértelműen egyediek abban, hogy képesek a GLP-1R aktiválására egy gyökeresen más kölcsönhatáskészlet révén anélkül, hogy a receptor és a GLP-1 peptid N-terminusa közötti kapcsolatokat használnák.