A legfontosabb kérdés megválaszolása még mindig váratott magára, hiszen továbbra sem volt ismert, hogy mi a talidomid, illetve a rokonvegyületeivel együtt összefoglalóan IMiD-eknek a fehérjecélpontja és hogy az onkológiai és a teratogén hatást milyen folyamatokon keresztül, mihez kapcsolódva érik el.

 

Az olyan első tanulmány 2010-ben jelent meg, amely megmutatta, hogy az IMiD-ek a cereblon (CRBN) fehérjéhez kapcsolódnak (Ito és mtsai, 2010). A CRBN egy úgynevezett E3-ligáz fehérjekomplexnek a szubsztrátfelismerő receptorrésze. Az E3-ligázoknak meghatározó szerepük van a sejt fehérjehomeosztázisában és körforgásában. A nem kívánt, hibás, vagy feleslegessé váló fehérjék jelentős része a sejtekben az E3-ligázok segítségével jelölődik meg (ubikvitinálódnak), majd a megfelelően felépült poliubikvitin-láncot a proteaszóma felismeri, és az azt hordozó fehérjét lebontja (Ubiquitin Proteasome System) (részletesen lásd 3.5. fejezet). Kezdetben még tévesen azt gondolták, hogy az IMiD-ek a CRBN-hoz kötődve gátolják az E3 ligáz aktivitását, de a CRBN mint elsődleges célpont felismerése és ennek megerősítése (Lopez-Girona és mtsai, 2012) nagy előrelépés volt a működési mód tisztázásában.

 

Az IMiD-ek fejlesztésében 2014 az áttörés éve volt, mely során két Science-, egy Nature-, valamint számos más közlemény jelent meg (Lu és mtsai, 2014, Kronke és mtsai, 2014, Fischer és mtsai, 2014, Gandhi és mtsai, 2014), amelyekben tisztázták az IMiD-ek működési mechanizmusát. Ez teremtette meg az irányított fehérjelebontás (targeted protein degradation, TPD) mint új modalitás alapjait is. A molekuláris hatásmechanizmus kísérleti bizonyítékainak kulcseleme egy úgynevezett hármas komplex szerkezetének röntgendiffrakcióval történő azonosítása volt (5.5.2. ábra). A szerkezet alapján megállapítható volt, hogy a CRBN-t is tartalmazó E3-ligázhoz, teljes nevén CUL4–RBX1–DDB1–CRBN komplexhez (röviden CRL4CRBN) kapcsolódik az IMiD molekula, valamint ennek közvetítésével az IKZF1 (Ikaros) vagy IKZF3 (Aiolos) nevű transzkripciós faktor közül valamelyik, így létrehozva a hármas komplexet. A komplex kialakulása következtében az E3-ligáz ubikvitinnel jelöli meg az IKZF1-et vagy IKZF3-at, amely további ubikvitineződést követően lebontásra kerül a proteaszóma által. Továbbá kimutatták, hogy az IKZF1 és IKZF3 fehérjék az IMiD jelenléte nélkül nem mutatnak affinitást a CRBN-hoz, tehát az IKZF1 vagy az IKZF3 nem természetes partnere a CRBN-nak, így ezeket ún. neoszubsztrátnak nevezték el. Innentől felgyorsultak az események, és a proteomika eszközeinek segítségével világszerte kutatások indultak az esetleges más új neoszubsztrátok, fehérjecélpontok keresésére. A három legismertebb IMiD hatóanyag által a CRBN-hoz kapcsolt neoszubsztrátjai az 5.5.2. táblázatban láthatóak (Donovan és mtsai, 2018). Látható, hogy az IMiD igen kicsi szerkezeti változtatására (egy plusz aminocsoport: talidomid → pomalidomid; vagy karbonil helyett metilén: pomalidomid → lenalidomid) a szubsztrátspecificitás és a lebontási hatékonyság nagymértékben megváltozik.

 

 

Elsőként a CRBN-komplexhez kötődő IMiD-ek röntgenszerkezete lett ismert (PDB: 4CI1, 4CI2, 4CI3), majd olyan hármas komplexek (valójában multiplex komplexek) is nyilvánossá váltak, mint a CRBN–pomalidomid–ZNF692 (PDB: 6H0G), illetve a CRBN–lenalidomid–CK1α (PDB: 5FQD). Közös ezekben a komplexekben, hogy fehérjestabilitási okokból a CRL4-komplex egy további elemét, a DDB1 fehérjét is tartalmazzák.

 

 

A növekvő számú azonosított CRBN-neoszubsztrát között nem volt nehéz a kutatóknak összefüggést találni. Közös bennük, hogy szinte mindegyik egy ún. „cinkujj”- (zinc finger) motívumot tartalmaz, amelyek a „klasszikus cinkujjnak hívott” szekvenciával rendelkeznek. Ebben két cisztein és két hisztidin felelős a cink megkötéséért, egyszerűbben Cys2His2 vagy C2H2-nek jelölik ezt az alcsoportot. A röntgenszerkezetek szerint a C2H2-t tartalmazó motívum, mint egy lasszó közelít a CRBN-hoz, és létesít kölcsönhatást vele (Buhimischi és mtsai, 2019, Sievers és mtsai, 2018).

 

A neoszubsztrátok feltréképezése segítette a talidomid káros mellékhatását okozó molekuláris folyamatok megértését is. Az embrionális fejlődési fázisokért felelős SALL (Spalt-like) gének által kódolt SALL4 (Sal-like protein 4) fehérje, amely transzkripciós faktor, lebontását tekintik a teratogén hatásért felelős biokémiai folyamatok első lépcsőjének (Donovan és mtsai, 2018, Matyskiela és mtsai, 2020). Azt a korábbi megfigyelést, hogy rágcsálókban, azaz egér- és patkánymodellekben nem tapasztaltak fejlődési rendellenességet a talidomid alkalmazása során, Donovan és munkatársai meg tudták magyarázni azzal, hogy a rágcsálókban és halakban nem, de nyúlban, főemlősökben és emberekben megfigyelhető a CRBN-hoz köthető SALL4 lebontása. Ezt arra lehetett visszavezetni, hogy mind a CRBN, mind a SALL4 fehérjékben a lebontás szempontjából kritikus hármas komplex kapcsolódási pontjain más-más aminosavak találhatóak a különböző fajokban. Ez azt jelentette, hogy az emberi sejtekben CRBN-hoz azonosított cinkujj-motívumot tartalmazó neoszubsztrátok nem feltétlenül bontódnak le rágcsálókban is. Ebből a példából is látható, hogy egy hatóanyag által kiváltott hatás fajspecifikus lehet, különösen akkor, ha nem egy, de két kölcsönható fehérje szekvenciájában is kritikus eltérések vannak. Amennyiben nem vagyunk tisztában ezzel a fajspecifikus hatással, úgy a toxikológiai vizsgálataink során téves biztonságérzet alakulhat ki.

 

Bár a kutatások során egyre több részlet derült ki az IMiD-ek molekuláris hatásmechanizmusáról, a kirakónak egy fontos eleme még mindig hiányzott. Mi a természetes szubsztrátja a CRBN-nak? Erre a kérdésre azért fontos választ kapnunk, mert az IMiD-ek e természetes szubsztrát(ok) kötődését gátolják, aminek szintén lehet nemkívánatos következménye. Kezdetben számos gyógyszerkémiai cikk jelent meg arról, hogy a glutárimidgyűrű közeli és távoli analógjai is mutatnak mikromólos CRBN-kötődést anélkül, hogy bármilyen további szubsztituens lenne a gyűrűn (Boichenko és mtsai, 2018). Fontos kiemelni, hogy itt most csak a CRBN-hoz való kötődésről beszélünk és nem lebontásról. Egészen 2022-ig kellett várni, míg kutatók alapos vizsgálatok alapján arra a következtetésre jutottak, hogy a CRBN-nak „eltakarító” funkciója van, amely minden olyan hibás fehérjét felismer és lebontásra küld, amelynek a vége a glutársav nemkívánatos ciklizációjában kialakuló, glutárimidszerű gyűrűt hordoz (Ichikawa és mtsai, 2022; Heim és mtsai, 2023). Ennek megfelelően a CRBN kevéssé érzékeny a fehérje többi részére, csak a hibás egységre. Egy frissebb tanulmányban a CRBN endogén fehérje célpontjának azonosították a MORFL4L1-et is (Zhang és mtsai, 2025).

 

Az IMiD-ek molekuláris hatásmechanizmusának részletes feltárása farmakológiai szempontból is mérföldkő volt. Korábban az ún. kötőhely-telítettségi (occupancy-driven) paradigma volt a meghatározó, miszerint a hatás elérésében a kötőzsebhez való kötődés erőssége (affinitása), a telítettsége és a kötődés kinetikája voltak az elsődlegesen meghatározó paraméterek. A kötőhely-telítettségi farmakológiában az egyensúlyok dominálnak, míg a molekulárisragasztó-lebontók hatásosságát elsősorban a lebontás határozza meg, ami során a célfehérje eltűnik a sejtből. (5.5.3. ábra) A lebontási folyamat mechanizmusa, elemi lépései jól ismertek, bár még mindig sok kérdés merül fel, elsősorban a biológiai következmények oldaláról. A leegyszerűsített működését tekintve a fehérjelebontás katalitikus folyamat, ami elméletben a hatóanyag kisebb koncentrációját igényli a kívánt hatás eléréséhez, mint egy inhibitor esetében. Ugyanakkor a fehérje kivonása a rendszerből erősebben befolyásolhatja a biológiai folyamatok visszacsatolási rendszerét, mint a gátlás esetén (Petterson és mtsai, 2019).