A PPI-modulátorok és a hagyományos gyógyszerek közötti legfontosabb gyógyszerkémiai különbségeket a COX-2 enzimgátló ibuprofén és az MDM2-gátló Nutlin-3a kötődési módjának összehasonlítása szemlélteti a 3.2.1. ábrán.

Tekintettel arra, hogy a fehérje–fehérje kölcsönhatások kialakulása során a célfehérje megfelelő interfészrégiójában a másik fehérje peptidlánca kötődik, a kölcsönhatások befolyásolására a peptidek és a peptidanalógok szinte önként adódnak lehetőségként. A peptidek ugyan a sekély interfészeken is képesek megfelelő számú és minőségű kölcsönhatást kialakítani, azonban fizikai kémiai tulajdonságaik, stabilitásuk és membránpenetrációs képességük jelentősen eltér a klasszikus kismolekulás gyógyszerjelöltekétől. A ciklikus peptidek viszonylag kis méretük, korlátozott polaritásuk, kémiai stabilitásuk, valamint megfelelő membránpermeabilitásuk miatt jelentős figyelmet kaptak az elmúlt évtizedben (Garcia Jimenez és mtsai, 2023). Gyűrűs szerkezetüknek köszönhetően nagy konformációs stabilitással rendelkeznek, ami lehetővé teszi a kihívást jelentő célpontokhoz való erős és specifikus kötődést. A klasszikus kismolekulákhoz képest nagyobb méretük miatt az interfésszel elegendő kölcsönhatási felületen érintkeznek, azonban polaritásuknak és a szerkezetüket stabilizáló, jellemzően belső hidrogénkötéseknek köszönhetően intracelluláris célpontokat is képesek elérni, sőt egyesek akár szájon át is alkalmazhatók (Over és mtsai, 2016).

A makrociklusok 12 vagy több atomból álló, gyűrűs molekulák, közülük számos természetes példa 14, 16 vagy 18 tagú gyűrűt tartalmaz, sőt, néhány az 50 atomot is meghaladja. A természet gazdag forrása a makrociklusos molekuláknak, ezen belül is a ciklikus peptideknek, amelyek változatos méretekben, szerkezetben és összetételben fordulhatnak elő. Gyógyászati jelentőségüket szerteágazó biológiai aktivitásuk mellett jól mutatja, hogy napjainkban több mint 40 ciklikus peptidet, illetve ezek származékait használnák terápiás célokra (Zorzi és mtsai, 2017). Jó példa erre az immunszupresszáns hatású ciklosporin, a ciklikus peptidhormon oxitocin vagy az antibiotikumként használt vankomicin (3.2.2. ábra).

 

A ciklikus peptidek általában nagyobb affinitással tudnak kötődni a célpontokhoz, mint a megfelelő lineáris analógok (Hill és mtsai, 2014). Ennek hátterében az esetek többségében entropikus hatások állnak. A ciklikus szerkezetnek köszönhetően a peptidek konformációs szabadsági foka kisebb, mint a nyílt láncú származékoké, így a kötődés során csak kisebb konformációs változások történnek, amelyek esetében az entropikus büntetés is kisebb. Fontos megjegyezni, hogy a ciklikus peptidek összességében is kevesebb lehetséges konformációt vehetnek fel, ezért a kötődésre alkalmas konformációk betöltöttsége is magasabb, mint a lineáris peptidek esetében. Ennek okán a ciklikus peptidek esetében a kötődési esemény bekövetkezésének valószínűsége nő. A ciklikus peptidek esetében tapasztalt szelektivitás is a korlátozott konformációs mobilitással hozható összefüggésbe, ugyanis a kevésbé flexibilis peptidgerinc miatt a ciklikus peptidek kevésbé képesek kölcsönhatásokat kialakítani a célpont kötőhelyétől lényeges különböző fehérjefelszínekkel. A 3.2.3. ábrán bemutatott példák jól illusztrálják a ciklizációval elérhető hatékonyság- és szelektivitásnövekedést.

 

A ciklikus peptidek egyik legfontosabb tulajdonsága, hogy bár poláris aminosavakból épülnek fel, ami elvileg jelentősen korlátozná az apoláris membránokon történő átjutásuk lehetőségét, kellő körültekintéssel mebránpermeábilis ciklikus peptidek állíthatók elő. A mebránokon történő passzív transzport sikerének záloga, hogy a a peptidek poláris csoportjait, például a peptidkötések hidrogén- (H-) kötés donorjait deszolvatálni kell annak érdekében, hogy a peptid be tudjon lépni az apoláris membránfázisba. A deszolvatáció azonban energiaigényes folyamat, így a membránba való belépésnek energiagátja van, ami megakadályozza a peptidek membránpenetrációját. A természetben előforduló ciklikus peptidek esetében azonban megfigyelték, hogy a ciklizáció elősegítheti a peptideken belüli intramolekuláris H-kötések kialakulását (3.2.4. ábra).

 

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy kedvező kötődési tulajdonságaik, szelektivitásuk, kémiai stabilitásuk és potenciális membránpermeabilitásuk miatt a ciklikus peptidek komoly lehetőséget jelentenek a fehérje–fehérje kölcsönhatások célzása területén. Különösen igaz ez olyan intracelluláris fehérje–fehérje kölcsönhatások esetében, amelyeket a klasszikus kismolekulás megközelítésekkel nem sikerült megcélozni.

A ciklikus peptidek előnyös sajátságai alapján széles körű kutatómunka indult olyan módszerek kifejlesztésére, amelyeknek a segítségével célpontspecifikus membránpermeábilis ciklikus peptideket lehet kifejleszteni.

A legegyszerűbb módszer a Furka Árpád által kidolgozott klasszikus osztásos-keveréses eljárás alkalmazása, amelynek alapjait a 4.5. fejezet ismerteti. A módszer lényege, hogy műanyag mikrogyöngyök felhasználásával a monomerekből változatos könyvtárak építhetők. Az eljárásban párhuzamos reakcióedények alkalmazásával a mikrogyöngyökhöz kapcsolt momomerek gyűjteményét több reakcióra osztották fel, amelyekhez az egyes kémiai építőelemeket párhuzamosan kapcsolták. A reakciók lejátszódását követően a gyöngyöket összekeverik, és a folyamatot a kívánt számú alkalommal megismétlik. Az eljárás végén egy olyan gyöngykeveréket kapnak, amelyben minden egyes gyöngy egy vegyületet tartalmaz (One Bead – One Compound: OBOC). Az így kapott gyöngyöket legtöbbször ún. „on-bead” technológiával szűrik, amelynek során fehérjecélpontot a gyöngyökkel inkubálják, majd az adott gyöngy kötődését fluoreszcens festékkel vizualizálják. Az így azonosított kötődő gyöngyöket ezt követően mikroszkópiával szét lehet választani, majd a peptideket Edman-féle lebontással és tömegspektrometriával lehet azonosítani (Lee és mtsai, 2010).

A DNS-kódolt könyvtárak segítségével az előállított könyvtártagok azonosítása lényegesen egyszerűbbé válik. Az eljárás lényege, hogy az egyes monomereket logikailag egyedi DNS-töredékekhez kapcsolják, így a képződött termékek a hozzájuk kapcsolódó DNS-jelölők egyedisége miatt azonosíthatóvá válnak. A DNS-kódolt könyvtárak szintézisére két fő szintézisstratégiát alkalmaznak: az egyik az osztásos-keveréses eljárás DNS-kódolással, míg a másik az ún. DNS-templátszintézis, amely végeredményben DNS-templátok által vezérelt oldatfázisú szintézis. Az osztásos-keveréses módszer alkalmazása során külön reakcióedényekben reagálnak az építőelemek (monomerek) és a kapcsolt egyedi DNS-szekvenciák. Ezzel szemben a DNS-templátszintézis egyetlen edényben zajlik, ahol egyszálú DNS jelenti a templátot, és a komplementer építőelemek nukleotid bázispárosítással kapcsolódnak a megfelelő szekvenciákhoz, ezzel lehetővé teszik a kívánt molekulák programozott szintézisét a keverékben. A DNS-kódolt könyvtárakat általában az OBOC-könyvtárakhoz hasonlóan affinitásszelekcióval szűrik. Ennek során a célponthoz nem kötődő vegyületeket kimossák, majd a kötődő származékokat DNS-amplifikációval és szekvenálással azonosítják. Az eljárást sikeresen használták ciklikus peptidkönyvtárak előállítására. Így DNS-templátszintézissel 92 nem kanonikus aminosav felhasználásával 256 000 tagból álló könyvtárat állítottak elő (Usanov és mtsai, 2018). Egy másik alkalmazás során 422 kanonikus és nem kanonikus aminosav-építőelem felhasználásával és a ciklizációt rézkatalizált azid–alkin-cikloaddícióval (CuAAC) végezve 1,25 millió DNS-kódolt ciklikus peptidet tartalmazó könyvtárat szintetizáltak (Onda és mtsai, 2021). A könyvtárak mérete a felhasznált építőelemek és az alkalmazott reakciólépések számával drasztikusan növelhető. Három reakcióciklussal és 350–500 Fmoc-védett aminosav felhasználásával egy 1,5 milliárd tagú CuAAC-ciklizált DNS-kódolt ciklikus peptidkönyvtár előállítása vált lehetővé (Silvestri és mtsai, 2023).

A kémiai szintézislehetőségek mellett a ciklikus peptidek előállítása biológiai eljárásokkal is megoldható. Ezek közé tartozik a fágmegjelenítés, amelynek során az exogén peptideket fonalas fágokba transzfektálják, és a fág felszínén jelenítik meg, így kovalens kapcsolat jön létre az egyes peptidek és a genetikai kódjuk között (Smith, 1985). Az így előállított peptidek ciklizációja különböző módszerekkel történhet, ilyen például a ciszteinek oxidatív kapcsolása vagy elektrofil linkerekkel való reakciója (Heinis és mtsai, 2009). Az így kapott könyvtárat az immobilizált célfehérjével inkubálják, aminek következtében a nagy affinitású peptidek a célponthoz kötődnek. Az immobilizált célpontot ezután mossák, és a megkötött fágokat baktériumokkal fertőzik meg az amplifikáció céljából. Ezt a folyamatot három-négyszer megismételve a kötődött ciklikus peptideket DNS-szekvenálással azonosítják. A fágmegjelenítés monomerként a 20 természetes aminosavat használja, és általában 109 méretű ciklikus peptidkönyvtár létrehozását teszi lehetővé.

A ciklikus peptidek előállításának egy további módja az mRNS-megjelenítés, amelynek során a peptideket sejtmentes in vitro rendszerben az őket kódoló DNS-könyvtárból transzlálják (Huang és mtsai, 2019). Minden peptid kovalens módon, puromicinen és egy rövid DNS-linkeren keresztül kapcsolódik mRNS-ének 3’-végéhez. Mivel az mRNS-megjelenítés sejtmentes rendszerben működik, a módszer alkalmas nem természetes aminosavak beépítésére is. A peptidek ciklizálhatók egy rendelkezésre álló cisztein-oldallánc és egy N-terminális klór-acetilcsoport közötti reakcióval. Az mRNS-hez kapcsolt ciklikus peptidek könyvtárait fágmegjelenítéshez hasonló módon szűrik immobilizált célpontokkal szemben. A kötődött ciklikus peptideket elválasztják, majd reverz transzkripcióval, PCR-amplifikációval és a kapott DNS-szekvenálásával azonosítják. Az mRNS-megjelenítés jellemzően nagyobb, akár 1012 tagú könyvtárak létrehozását is lehetővé teszi.

Ciklikuspeptid-könyvtárakat kereskedelmi forgalomban is be lehet szerezni. A 3.2.1. táblázatban az ilyen egyedi, tisztított makrociklusokat tartalmazó könyvtárakat foglaltuk össze. Ezek a könyvtárak azonban a Spirochem által kínált gyűjtemény kivételével nemcsak ciklikus peptideket, hanem nem peptid jellegű makrociklusokat is tartalmaznak. A tisztított könyvtárak esetében hagyományos biológiai szűrővizsgálatokat alkalmazhatunk a célponthoz kötődő könyvtártagok azonosítására.

 

A JNJ-77242113 (JNJ-2113 néven is ismert) orálisan adagolható (F = 6% patkányban) ciklikus peptid, amely hatékonyan és szelektíven képes gátolni az interleukin-23 receptort (IL-23R), és ezzel új terápiás lehetőséget teremt az immunmodulált gyulladások, így a pszoriázis kezelésére (Bissonnette és mtsai, 2024). A vegyület orális alkalmazhatósága jelentős előrelépést hoz az eddig főleg parenterálisan alkalmazott biológiai terápiákhoz képest. A JNJ-77242113 felfedezéséhez egy fágbemutatás-alapú szűrés vezetett, amelynek során diszulfidkötésekben gazdag ciklikuspeptid-könyvtárakat vizsgáltak. Az ennek eredményeként azonosított gyógyszerjelölt kivételesen nagy hatékonysággal kötődik az IL-23 receptorhoz (KD = 7,1 pM), és megakadályozza az lL-23-indukálta STAT3-foszforilációt (IC50 = 5,6 pM). Szelektivitására jellemző, hogy a célfehérje hatékony gátlása mellett az IL-12-jelátvitelre semmilyen hatást nem gyakorol. A fázis 2 vizsgálatokban közepesen súlyos és súlyos pszoriázisban szenvedő betegeken vizsgálva dózisfüggően csökkentette a betegség tüneteit és a bőr sérüléseit.

Utolsó példaként egy intracellulárisan működő ciklikus peptidet mutatunk be, amely egyedülálló módon képes gátolni az onkológiai megbetegedések mintegy 30%-ában szerepet játszó fehérjét, a KRAS-t (Tanada és mtsai, 2023). A LUNA18 kódjelű gyógyszerjelölt felfedezéséhez vezető kiindulópontot „mRNA display” technológiával azonosították; a vegyület sikeresen gátolta a KRAS fehérje aktiválódásáért felelős KRAS-SOS1 fehérje–fehérje kölcsönhatást. A kiindulópont optimalizálása során javítani kellett annak membránpermeabilitását és orális biohasznosulását. Az optimalizáció az egyes oldalláncok módosításával korábban fel nem tárt kötőzsebet nyitott meg, és hozzájárult a kötődési affinitás további javításához. A membránpermeabilitás optimalizálása érdekében szisztematikusan változtatták a gyűrűt felépítő peptidkötések metilezettségét. Ezek a változtatások ugyan jelentősen befolyásolták a ciklikus peptid N-metilációs mintázatát, azonban a kötődési vizsgálatok tanúsága szerint nem okoztak drasztikus változást a kötődési affinitásban. Végül a hatékonyság további javításának érdekében kísérletet tettek a biológiai aktivitásért felelős konformáció stabilizálására. Érdekes módon a kötődési affinitást nem sikerült javítani, ugyanakkor az NMR-vizsgálatok igazolták, hogy a membránra jellemző kis dielektromos állandóval rendelkező közegben a változások hatására egyetlen konformáció alakul ki, amelynek lényegesen jobb a permeabilitása. Ennek következményeképpen a vegyület orális biohasznosulása négy különböző fajban 21% és 47% között alakult, ami lehetővé tette a human klinikai vizsgálatok megkezdését.