A gyógyszerkutatás gyakorlatában hosszú időn át kerülendőnek számítottak azok a vegyületek, amelyek a szervezetben kovalens kötést alakítanak ki a fehérjék nukleofil aminosav-oldalláncaival, illetve más endogén nukleofilekkel. Ugyanakkor viszont a jelenlegi terápiás gyakorlatban alkalmazott gyógyszerkincsben közel 50 olyan forgalomban lévő gyógyszert is találunk, amelynek hatásmechanizmusában meghatározó szerepet játszik a célfehérjével kialakuló kovalens kölcsönhatás (Boike és mtsai, 2022). Miközben a különösen nagy reaktivitással rendelkező vegyületek alkalmazását az esetlegesen fellépő hepatotoxicitási, karcinogenitási és mutagenicitási, valamint a kovalens fehérjemódosítás miatt kialakuló immunogenitási problémák miatt továbbra is kerülni kell, a kovalens gátlószerek alkalmazásának számos előnye lehet (Bauer, 2015). Ezek között az előnyök között elsőként a nagy hatékonyságot érdemes említeni, ugyanis a célfehérjéhez kovalensen kötő gyógyszerjelölttel teljes gátlás érhető el. A kovalens hatásmechanizmusú molekulák kötődése kétlépéses folyamatban valósul meg. Az első lépésben kialakul a hagyományos nem kovalens komplex, majd ezt követően a kovalens ligandum elektrofil funkciós csoportja kovalens kötést alakít ki a célfehérje közelben lévő nukleofil aminosavával (3.3.1. ábra). A kovalens ligandumok által leggyakrabban jelölt aminosavak között találjuk az erősen nukleofil ciszteint, a lizint, a tirozint, a szerint és a hisztidint.

 

 

A kovalens ligandumok molekuláris felismerése egyensúlyi folyamat, amelyet a KI = koff/kon egyensúlyi állandóval jellemezhetünk. Ideális esetben az egyensúly a komplex irányában van eltolva, így a ligandum elegendően hosszú tartózkodási időt tölt a kötőhelyen ahhoz, hogy a második lépésben az egymáshoz térben közel kerülő elektrofil (ligandum) és nukleofil (célfehérje) funkcionalitások a kinact sebességi állandóval jellemezhető kémiai reakció eredményeképpen új kovalens kötéssel kapcsolódjanak egymáshoz. Amennyiben az elektrofil ligandum és a nukleofil aminosav-oldallánc közti kémiai reakció reverzibilis (pl. Michael-addíció cianoakrilátok és cisztein között), akkor a második, kovalens lépés is lehet reverzibilis, ami megteremti a lehetőséget a reverzibilis kovalens hatásmechanizmusú ligandumok fejlesztésére.

 

A klinikai gyakorlatban alkalmazott gefitinib és erlotinib esetében azonban az esetek több mint felében rezisztencia alakult ki, amelyet a célpont egy specifikus mutációjára (T790M) lehetett visszavezetni. Ez a mutáció a fehérje ATP-kötőhelyének közelében alakul ki, és jelentős mértékben csökkenti a reverzibilis inhibitorok hatékonyságát. A rezisztencia okozta hatékonyságcsökkenés elkerülésére merült fel a második generációs kovalens EGF- inhibitorok fejlesztésének gondolata. A fejlesztés során a már ismert első generációs gátlószerekből indultak ki és ezek szerkezetébe akrilamid típusú Michael-akceptort építettek be, amely képesnek bizonyult kovalens kötést kialakítani a kötőhelyen található nem katalitikus Cys797 SH-csoportjával. Az így nyert második generációs gátlószerek részben képesek voltak visszaállítani a rezisztencia kialakulása előtt tapasztalt hatékonyságot, és egyben azt is megmutatták, hogy az EGFR irreverzibilis gátlása már az első vonalban is hatékonyabb kezelést eredményez, mint amilyen az első generációs reverzibilis inhibitorokkal elérhető volt (Ou, 2012). Ugyanakkor a klinikai vizsgálatok arra is rámutattak, hogy a mutációkat nem tartalmazó EGFR-receptor egyidejű gátlása dóziskorlátozó mellékhatásokat okoz a betegekben. E mellékhatások elkerülésére fejlesztették ki a harmadik generációs EGFR-gátlókat, amelyek szelektíven a T790M mutáns receptorra hatnak. A vad típusú receptorral szemben megkívánt szelektivitás eléréséhez a hatékonyságot biztosító kovalens hatásmechanizmus megőrzése mellett a vegyületek nem kovalens alapvázát kellett módosítani oly módon, hogy a kovalens kötődés első lépésében a vegyületet kizárólag a T790M mutáns receptor ismerje fel. Ennek érdekében az első és második generációs vegyületekben alkalmazott kinazolinvázat a harmadik generációs ozimertinib és rocelitinib esetében pirimidingyűrűre cserélték (Butterworth és mtsai, 2017). A harmadik generációs kovalens hatásmechanizmusú EGFR-gátlók jelenleg hatékony és biztonságos terápiát jelentenek a primer és áttétes, nem kissejtes tüdőkarcinómák kezelésében.

 

A pirazolo-pirimidin-vázat tartalmazó találat hatékonyan gátolta a BTK-t (IC50 = 8 nM), emellett számos más Tec és Src családba tartozó kinázon is számottevő aktivitást mutatott. A BTK-szelektivitás növelésének érdekében merült fel az a lehetőség, hogy egy, csak a célfehérje kötőhelyén jelen lévő nukleofil aminosavat választva a kovalens módosításra, a vegyület jelentős BTK-szelektivitással rendelkezhet. A nem kovalens származék kötőkonformációját számításos módszerrel előre jelezve azt találták, hogy a ciklopentilgyűrű közelében helyezkedik el a Cys481 aminosav, amelyet egy célszerűen választott Michael-akceptorral el lehet érni. Így jutottak a megfelelő piperidil-akrilamid-származékhoz, amely kovalens kötést alakított ki a célzott aminosavval. A kedvezőbb enantiomer azonosításával jutottak el ahhoz a vegyülethez, amelyet eredetileg a BTK fluoreszcens jelölésére szántak, végül azonban 2013-ban ibrutinib néven törzskönyvezték a krónikus limfoid leukémia kezelésére.

 

A 3300 tagú elektrofil könyvtár szűrésével összesen 8, tömegspektrometriával is megerősített találatot azonosítottak, amelyek közül a további optimalizációra a 3.3.5. ábrán látható vegyületet választották. Az optimalizáció első lépésében a molekuláris felismerésre szolgáló fragmenst változtatták, így jutottak a megfelelő indolszármazékhoz, amelyet ezt követően ismét csali molekulává alakítottak és a megfelelő fragmenskapcsoló csoport kialakítását követően további fragmensvázakkal kombinálták (3.3.5. ábra).

 

Végül a legkedvezőbbnek adódott dihidro-izokinolin-vázat tovább optimalizálva jutottak a vezérmolekulához, amelynek szerkezetvizsgálata feltárta, hogy a KRAS G12C fehérjéhez kötődve a molekula egy a His96 aminosav által takart, addig fel nem tárt kötőzsebet nyitott meg (3.3.6. ábra). Ugyanakkor viszont a farmakokinetikai vizsgálatok alapján a vezérmolekula orális biohasznosulása elmaradt a várakozásoktól. A vezérmolekula kötőmódját egy ismert kovalens hatásmechanizmusú referenciamolekulával, az ARS-1620-szal összevetve nyilvánvalóvá vált, hogy annak farmakokinetikai szempontból kedvezőbb tulajdonságokkal rendelkező vázát érdemes kombinálni a vezérmolekula vázával. Így az újonnan feltárt kötőzsebnek köszönhető hatékonyság és az orális biohasznosulás feltételei is teljesültek (Lanman és mtsai, 2020).

 

A kombinált vázrendszernek köszönhetően a szotoraszib-molekula teljes egészében képes kitölteni a rendelkezésre álló kötőzsebet (switch II), a gyógyszerjelöltként választott atropizomer pedig ideális orientációt biztosít a reaktív akrilamid ciszteinnel történő reakciójához. A szotroraszibot, mint az első hatékony KRAS G12C inhibitort, 2021-ben engedélyezték áttétes nem kissejtes tüdőkarcinóma kezelésére.

 

Ez a vegyület reaktív csoportként hidroxi-keton-funkciót tartalmazott, amely kovalens kötést alakított ki a főproteáz katalitikus ciszteinjével. A vegyület a homológ SARS-Cov-2 főproteázon is meglehetősen aktívnak bizonyult (Ki = 4 nM) és a SARS-Cov-2 fertőzés sejtes modelljében is ígéretes hatékonyságot mutatott (EC50 = 231 nM). A vegyület nem kovalens felismerésért felelős molekularészletei közül kiemelkedő fontosságú a P1 pozícióban elhelyezkedő γ-laktám, amely a természetes szubsztrát glutamin aminosavának felel meg, és alapvető szerepe van a kötőhely S1 zsebének felismerésében. A laktámgyűrű alkalmazása azért is szükséges, mert ebben a pozícióban eredetileg szereplő szabad amincsoportot tartalmazó glutamin-oldallánc feltehetően intramolekuláris reakcióban reagált volna a közvetlen közelében található reaktív elektrofil funkcionalitással. Ráadásul a laktámgyűrű merevsége egyben csökkenti a flexibilis glutamin felismerésénél jelentkező entropikus vesztességet. A PF-00835231 molekula legnagyobb problémája az elégtelen orális biohasznosulás volt. Az orális adagolás lehetősége ugyanakkor kulcsfontosságú a hatékony vírusellenes védekezés szempontjából. Egyrészről az antivirális kezelést a Covid–19 betegség első, ún. virális szakaszában kell alkalmazni, amikor a betegeknek általában még enyhe tünetei vannak, azaz kórházi ellátásuk nem indokolt. Másfelől viszont a meglehetősen túlterhelt kórházi infrastruktúrát alapvetően a súlyos esetek számára szükséges fenntartani, amelyek döntően már a betegség gyulladásos fázisára jellemző, komplikációkkal terhelt állapotok. A PF-00835231 molekula farmakokinetikai profiljának optimalizálása céljából a Pfizer kutatói egy rokonvegyületekből álló molekulagyűjteményt hoztak létre olyan módon, hogy a membránpermeabilitás és a felszívódás javítása érdekében igyekeztek a H-kötés-donor funkciók számát csökkenteni. Ennek során elsőként a reaktív csoportot cserélték le a H-kötés-donort nem tartalmazó benzotiazol-7-il-keton, illetve nitrilcsoportokra. A nitrilszármazék patkányoknál fokozott orális felszívódást mutatott, de a PF-00835231-hez képest mind az enzimgátlási, mind pedig a sejtes tesztekben kisebb aktivitást. Ennek oka feltehetően az volt, hogy a reaktív csoport változtatásával a kovalens kötés kialakulása is más mechanizmussal történik, ehhez pedig a ciszteinnel történő sikeres reakció érdekében a reaktív csoportnak is más orientációban kell állnia. Ezért a molekula nem kovalens felismerésért felelős szerkezeti részletét újra kell optimalizálni. Így a következő lépésben a molekula P2 leucinrészét egy ciklikusan módosított prolinrészre cseréltek, amely jól illeszkedett a célfehérje S2 zsebébe. Ezt a változtatást a benzotiazol-7-il-keton reaktív csoporttal kombinálva ismét egy a PF-00835231 vegyületnél jobb membránpermeabilitással, de gyengébb aktivitással rendelkező vegyülethez jutottak. A hatékonyság javítása érdekében folytatták a nem kovalens kölcsönhatásokban érintett molekularészlet optimalizációját az S3 zseb irányába. Itt a molekula P3 pozíciójában az indolrészt trifluoracetamid-funkcionalitással helyettesítették, amely meghozta a várt eredményt, a molekula aktivitása jelentősen nőtt, miközben kedvező farmakokinetikai sajátságai is megmaradtak. Végül a jobb oldhatóság és sztereokémiai stabilitás, valamint a méretnövelhetőbb szintézis miatt reaktív csoportként a nitrilt választották. Ezt a döntést az is befolyásolta, hogy a nitrilcsoportot más cisztein-proteázok esetében is sikeresen alkalmazták ideértve olyan vegyületeket is, amelyeket az amerikai engedélyezési hatóság, az FDA is jóváhagyott. Így jutottak el a nirmatrelvir felfedezéséhez, amely hatékony és orálisan felszívódó antivirális gyógyszernek bizonyult a SARS-Cov-2-fertőzöttek kezelésében (Owen és mtsai, 2021). A kiterjedt optimalizáció ellenére azonban egy további gyenge pont maradt, ez pedig nirmatrelvir korlátozott metabolikus stabilitása. Tekintettel a kórházon kívül alkalmazható orális antivirális készítményekkel szemben jelentkező hatalmas orvosi igényre, ezt a problémát végül egy másik anitvirális készítmény együttes használatával oldották meg, ugyanis a kereskedelmi forgalomba került Paxlovid a nirmatrelvir metabolizmusát gátló ritonavirt is tartalmaz. A pandémia mérséklődésével a Pfizer kutatói ezt a problémát is orvosolták, további optimalizálás eredményeképpen jutottak a PF-07817883 (ibuzatrelvir) második generációs főproteáz gátlószerhez, amely orális adagolás után, immár önmagában is, kiemelkedő hatékonyságot biztosít a SARS-Cov-2 fertőzéssel szemben (Allerton és mtsai, 2024).