A molekuláris ragasztók (MG) kifejezést monovalens kismolekulákra alkalmazzuk, amelyek kooperatívan kötődnek egy PPI-interfészen. Tipikusan az MG-k alacsony vagy nem mérhető affinitással rendelkeznek legalább az egyik fehérjepartnerhez, és kötődésük során fokozzák az interfészen a kölcsönhatásokat a két fehérje között. Az MG-k kötődhetnek natív vagy nem natív/neomorfikus (funkciónyeréses) PPI-khez. Az MG-k másik altípusába tartozó PPI-stabilizátorok olyan fehérjepartnerekre hatnak, amelyeknek természetes affinitásuk van egymáshoz, és a kölcsönhatást az MG stabilizálja. Ez esetben a natív fehérje–fehérje kölcsönhatás a célpont, ami megkülönbözteti a PPI-stabilizátorokat az adott fehérje allosztérikus stabilizátoraitól. Az MG-k egy további altípusát alkotják a célpont aggregátorok, amelyek önasszociációt indukálnak a célpont lebontásával vagy anélkül. Ebben az esetben az MG-k kötődése magasabb rendű fehérjeaggregátumokat eredményez, általában igen váratlan módon. Az így létrejövő komplex jelentősen különbözik a célfehérje natív állapotától. A molekulárisragasztó-lebontók (molecular glue degraders, MGD) kifejezés az MG-k azon alosztályát jelenti, amelyben a kötődő partner egy E3 ubikvitin–ligáz (E3 ligáz). Az E3 ligázok ubikvitint visznek át egy szubsztrátfehérjére, hogy azt a fehérjét a proteaszóma felismerje és lebontsa. Az MGD-k natív vagy nem natív fehérjék E3 ligázok általi ubikvitinálódását tudják kiváltani, ami a fehérje proteaszómális lebontásához vezet.

Az MG-k, mint monovalens modalitások, néhány természetes vegyület kivételével tipikusan kis molekulatömegű vegyületek, és kedvező tulajdonságokkal rendelkeznek a további klinikai fejlesztéshez. Mivel az MG-k által célzott PPI-interfész jól definiált struktúrával rendelkezik, az egyes fehérjéknek nem feltétlenül kell jól definiált kötőzsebbel rendelkezniük. Így a korábban gyógyszerrel nem támadhatónak tartott célpontok, mint például a transzkripciós faktorok vagy az eredendően rendezetlen fehérjék (intrinsically disordered protein, IDP) megfelelő célpontok lehetnek az MG-k számára. Az MG-k minden altípusa, függetlenül attól, hogy natív vagy neomorfikus (funkciónyeréses) PPI-ket céloz, vagy hogy lesz-e fehérjelebontás a folyamat végén vagy sem, a molekuláris felismerésre támaszkodik, és kooperatív kötődést eredményez egy határfelületen. Az elmúlt 20 évben számos MG-példát azonosítottak. Felfedezésük a véletlenszerű felfedezésektől, ahol a hatásmechanizmus ismeretlen maradt, a legújabb, racionálisan tervezett MG-k példájáig terjedt. Általánosságban elmondható, hogy nagy erőfeszítések ellenére sem létezik jelenleg elfogadott módszer a célpontalapú, racionális gyógyszertervezésre MG-k bevonásával. A következőkben néhány példa segítségével áttekintjük a molekuláris ragasztók főbb típusait.

 

A 2-es típusú cukorbetegség terápiájában érdekes 14-3-3 és a szénhidrát-válaszelemet kötő fehérje (ChREBP) komplex stabilizátorainak azonosítására célzott virtuális szűrést alkalmaztak; ennek során egy PPI-stabilizátor foszfonátanalógot azonosítottak, amelyet tovább optimalizáltak és sejtes aktivitást értek el vele (Ge, 2012). Az optimalizált vegyület 14-szeresére stabilizálta a 14-3-3/ChREBP komplexet a fluoreszcencia-anizotrópia titrálásokban (3.4.2. ábra A). A különböző technológiákat alkalmazó fragmensalapú szűrések különösen eredményesek voltak a 14-3-3/partner stabilizátorok felfedezésében, és kisméretű kiindulópontokat biztosítottak a PPI-interfészek tipikusan komplex fehérjefelszíneinek célzásához. Fragmensalapú szűrés eredménye a 3.4.2. ábrán (B) látható vegyület, amely a PIN1 fehérje triptofánjával specifikus ππp interakciók révén stabilizálja a 14-3-3/PIN1 komplexet (Cossar, 2021). A 14-3-3/foszfopeptid komplexek kristályosodásának egyszerűsége elősegítette a szerkezetalapú krisztallográfiás fragmensszűrés alkalmazását, aminek során egy amidinfragmenset azonosítottak. Egy diszulfidkötési szűrésből (disulfide tethering screens) egy másik fragmens is azonosításra került. Mivel a két fragmens együtt kristályosításakor kedvező elhelyezkedést mutattak, összekötötték őket és tovább optimalizálták a molekulát, aminek eredménye a 3.4.2. ábrán (C) látható vegyület, ami 25-szörösére stabilizálta a 14-3-3g/ERa komplexet fluoreszcencia-anizotrópia titrálásokban (Visser, 2023). A 14-3-3/MG/partner hármas komplexek kristályszerkezetei megmutatták, hogy az MG úgy alakít ki kölcsönhatásokat mindkét partnerrel, hogy alacsony vagy nulla belső affinitást mutat az egyes kötődő partnerek iránt, de kooperatívan hat a natív PPI-k meglévő affinitásának fokozásával. Az előbbi kiragadott 14-3-3/partner stabilizátor példái bizonyították, hogy lehetséges az MG racionális fejlesztése natív PPI-re különböző szűrési módszerekkel, és bár a 14-3-3 stabilizátorok klinikailag nem validáltak, fejlesztésük segíti a szisztematikus felfedezési és optimalizálási keretrendszer megalkotását.

A BCL6 transzkripciós represszor BTB-doménjének és korepresszor peptid-kölcsönhatásának gátlására végzett nagy áteresztőképességű fluoreszcencia-polarizációs szűrés és azt követő optimalizálás a BCL6-inhibitorok mellett egy szerkezetileg nagyon hasonló, a BCL6-ot lebontó sorozatot is azonosítottak (Kerres, 2017). Míg a BI-3812 inhibitorként, a BI-3802 lebontóként működött (3.4.3. ábra), ami gyorsan indukálta a BCL6 ubikvitinációját és annak lebontását. Krio-elektronmikroszkópiás (krio-EM) vizsgálatok megmutatták, hogy a BI-3802 kötődése a BCL6 BTB doménjéhez a BCL6 magasabb rendű filamentumokká történő rendeződését váltotta ki (Slabicki, 2020), ami fokozott BCL6-ubikvitinációt eredményezett a SIAH1 E3 ligáz által. A BI-3802 vegyület a BCL6-dimerek közötti barázdában kötődött, és az így létrejött interfész hasonlított a dimer interfészhez, ami ezáltal kölcsönhatásba tudott lépni a szomszédos BTB-domén homodimerrel, és ez így további dimer-dimer kölcsönhatáshoz és polimerizációhoz vezetett.

A molekulárisragasztó-lebontók fehérjéket tudnak lebontatni úgy, hogy a lebontásra ítélt fehérjével (protein of interest, POI) és egy E3 ubikvitin–ligáz (E3 ligáz) partnerrel hármas komplexet képeznek, ami kiváltja a fehérje ubikvitineződését és annak lebontását a szervezet saját ubikvitinfüggő proteaszamális fehérjelebontó (ubiquitin–proteasome system, UPS) rendszerével. Az MGD feladata ebben a folyamatban az, hogy a POI-t és az E3 ligázt egy megfelelő térállású hármas komplexben tartsa ahhoz, hogy a fehérje transzubikvitineződése lejátszódjon az E2 enzimről, ami a fehérje további ubikvitinálódásához, majd degradációjához vezet. A kezdeti ubikvitinálódás(oka)t követően a hármas komplex elbomolhat, és míg a megjelölt fehérjét az UPS felismeri és lebontja, ami csökkenti a betegségben érintett fehérje szintjét a sejtben, addig az MGD újrahasznosulhat úgy, hogy egy másik fehérjét célozzon meg (3.4.4. ábra). Az MGD katalitikus, eseményvezérelt hatásmechanizmusa jelentősen különbözik a klasszikus inhibitorok kötődésalapú hatásmechanizmusától. Míg a kötődésalapú hatásmechanizmus megköveteli az inhibitorok folyamatos kötődését a fehérje célpontjához a megfelelő hatás elérése érdekében, addig a katalitikus hatásmechanizmus esetén a megfelelő koncentrációra csak addig van szükség, amíg a gyógyszer a fehérjéhez kötődve kiváltja a poliubikvitinálódást, amely a kívánt hatást, az érintett fehérje lebontását eredményezi (ez bővebben a IMid esettanulmányban kerül bemutatásra a 5.5. fejezetben).