Az irányított fehérlejebontás (Targeted Protein Degradation) egy új modalitás a gyógyszerkutatásban, amely potenciálisan képes olyan, betegségekhez köthető fehérjék aktivitását megváltoztatni, amelyeket kismolekulákkal csak nehezen lehetne célba venni. Számos fehérje esetében hagyományos kismolekulás inhibitorok kifejlesztése nehézségekbe ütközik vagy jelen tudásunk szerint nem is lehetséges („undruggable”), mert vagy az aktív helyeik, kötőzsebeik hidrofóbok, szélesek és sekélyek vagy nincsenek is aktív kötőhelyeik a funkciójukból eredően (pl. transzkripciós faktorok, PPI-ben részt vevő fehérjék). A célzott fehérjebontás a szervezet saját fehérjelebontó rendszerét, az ún. ubikvitin–proteaszóma rendszert (UPS) használja fel egy célfehérje lebontására, és így képes a kismolekulás inhibitoroknak „ellenálló” fehérjék mennyiségét megváltoztatni és funkciójukat befolyásolni. Az irányított fehérjelebontás során egy PROTAC (proteolíziscélzó kiméra) molekulával, más néven egy heterobifunkcionális lebontó molekulával megfelelő térközelségbe hozunk egy E3 ligázt (és a hozzá kapcsolódó E1 és E2 enzimeket) és a lebontásra szánt fehérjét (protein of interest, POI), amivel kiváltjuk a célfehérje (poli)ubikvitinálódását, majd lebontását. Ezen heterobifunkcionális kismolekulákban a két ligandumot egy összekötő elem (linker) köt össze. Az egyik ligandum a lebontásra szánt fehérjéhez, míg a másik egy E3 ubikvitin–ligáz komplexhez tud kapcsolódni. A lebontásra ítélt fehérje, PROTAC-molekula és E3 ligáz hármas komplex megfelelő térállása esetén kiválthatja a fehérje transz-ubikvitineződését az E2 enzimről, ami a fehérje (poli)ubikvitinálódásához vezet a következő folyamatokban. Az ubikvitinálódást követően a hármas komplex szétesik, és míg a megjelölt fehérjét a proteaszóma felismeri és lebontja, ami csökkenti a betegségben érintett fehérje sejtszintjét, addig a PROTAC-molekula újra hasznosulhat, hogy egy másik fehérjét célozzon meg (3.5.1. ábra). Hangsúlyozandó, hogy egy PROTAC-molekula fejlesztése és optimalizálása során a legfontosabb feladat a hármas komplex (E3 ligáz–PROTAC–POI) stabilitásának növelése, ami megfelelő térállás esetében ubikvitinálódást, majd lebontást eredményez.

 

A célzott fehérjebontás katalitikus hatásmechanizmusa (Mode of Action – MoA) és eseményvezérelt farmakológiája jelentősen különbözik a klasszikus inhibitorok kötődésalapú hatásmechanizmusától. Míg a kötődésalapú hatásmechanizmus a megfelelő hatás elérése érdekében megköveteli az inhibitorok folyamatos kötődését a fehérje célpontjához, ez reverzibilis kötődés esetén általában csak magas inhibitorkoncentrációnál érhető el. Az eseményvezérelt hatásmechanizmus esetén a szükséges koncentrációra csak addig van szükség, amíg a hatóanyag a fehérjéhez kötődve kiváltja a kívánt hatást, ami ez esetben a poliubikvitinálódás és az azt követő fehérjelebontás.

 

Bár a PROTAC-ok ígéretesek a hagyományos ligandumokkal nem támadható (undruggable) proteóma célba vételében, a fehérjék nem egyformán alkalmasak a célzott lebontási stratégiákhoz. A célpontként szolgáló fehérje TPD-re való alkalmasságának eldöntéséhez alapos előzetes vizsgálatokra van szükség. Ez olyan kérdésekre keres válaszokat, hogy például a célpont rendelkezik-e hozzáférhető lizinnel, ami az ubikvitinálódás alapfeltétele; vagy milyen a fehérje újraszintézisének sebessége (turnover), azaz a fehérjeelőállítás és -lebontás közötti dinamikus egyensúly eredménye. Könnyen belátható, hogy a kis felezési idejű fehérjék életciklusába nem érdemes beavatkozni, mert a lebontatott fehérje nagyon gyorsan újratermelődik. Léteznek prediktív próbálkozások is a TPD alkalmazhatóságának eldöntése érdekében. Ilyen a MAPD (Model-based Analysis of Protein Degradability), a fehérjelebontás modellalapú analízise, ami a fehérjeszubsztrátok lebonthatóságát jelzi előre a fehérje belső jellemzői alapján (Zhang, 2021). Napjainkig a PROTAC-technológiát számos különböző fehérje célbavételére használták, mint például a transzkripciós faktorok, a vázfehérjék, a nukleáris receptorok, enzimek és szabályozó fehérjék (Han, 2022).

 

Már a kutatómunka korai szakaszában érdemes több E3 ligázhoz kötődő PROTAC-sorozatot előállítani, mert ezek hatékonysága nagymértékben különbözhet egymástól. Ennek számos oka lehet, mint a különböző mértékű hármaskomplex-stabilitások, ezek ubikvitinelődéshez alkalmas térállása(i) vagy éppen az E3 ligázok különböző mértékű jelenléte a célzott szövetben, sejtben, illetve sejtkompartmentben, ami befolyással bírhat a szelektivitásra és a mellékhatásokra is. A fehérjecélponthoz kötődő ligandum kiválasztása során fontos, hogy a ligandum minél nagyobb hatékonysággal és szelektíven kötődjön a célfehérjéhez, ami lehet funkcionális kötő (inhibitor, aktivátor, modulátor), egy allosztérikus kötőpartner vagy éppen egy funkciót egyáltalán nem befolyásoló kötőmolekuls is (Békés, 2022).

 

Egy PROTAC-molekula fejlesztése során a legfontosabb feladat az ubikvitin átadására képes hármas komplex (POI-PROTAC-E3-ligáz) stabilitásának növelése, ami a POI-lebontást inicializálja. A hármas komplex kialakítására alkalmas PROTAC fejlesztése során általában számos, a ligandumokat különböző hosszúságú összekötő elemekkel (linker)il kapcsolt lebontó molekulák szintézisére kerül sor, amelyek során a proteinkötők oldószer felé nyitott kilépő vektorait is változtatjuk. Az összekötő elem hossza és minősége befolyásolhatja mind a ligandumok célponthoz kötődését, mind a hármas komplex képződését (POI–PROTAC–E3 ligáz), a sejtpenetrációt és egyéb farmakokinetikai tulajdonságait, ezért minden E3 ligáz- és POI-kötő pár esetében érdemes különböző hosszúságú és merevségű összekötőket kipróbálni (Bemis, 2021). A PROTAC-fejlesztés első lépésében érdemes egyszerű szénhidrogén- vagy polietilén-glikol- (PEG) elemek segítségével meghatározni egy körülbelül kedvező távolságot a ligandumok között, majd a linker módosításával optimalizálni, ami javíthatja a hármas komplex stabilitását, a kooperativitást, a merevséget vagy éppen a fizikai kémiai tulajdonságokat, például a teljes poláris felületet, az oldhatóságot, a permeabilitást vagy a biohasznosulást.

 

ahol az 1-nél nagyobb értékek pozitív kooperativitást jeleznek, az 1 érték nem kooperatív komplexeket jelöl, míg az 1-nél kisebb értékek negatív kooperativitást mutatnak (Roy, 2019). A kooperativitást befolyásoló tényezők között szerepel, hogy az E3 ligáz és a célpont POI új fehérje–fehérje érintkező felületet (interfészt) képez a hármas komplexben, ami termodinamikailag kedvező vagy kedvezőtlen lehet. Különböző PROTAC-molekulák különböző kooperativitást eredményezhetnek ugyanazon célpont POI–E3 ligáz pár esetében (Schiemer, 2021), ami lehetőséget nyújt a PROTAC-molekula optimalizálására a hatékony hármas komplex kialakítása és a célpontlebontás érdekében. Egy adott PROTAC különböző kooperativitást indukálhat két nagyon hasonló POI között, amikor ugyanazzal az E3 ligázzal alkot hármas komplexet (Gadd, 2017, Smith, 2019), lehetőséget adva szelektív lebontók tervezésére egy promiszkus ligandum esetében is (Bondeson, 2018).

 

A PROTAC-molekulák fejlesztése során fontos, hogy a lebontó molekula adagolásától kezdve a sejten belüli lebomlásig követni kell a részfolyamatokat, ahol minden szakaszt specifikus paraméterek jellemeznek, amelyek testre szabott vizsgálatokkal és technikákkal követhetők nyomon (3.5.5. ábra és 3.5.6. ábra, Hughes, 2017). A folyamat a PROTAC kémiai stabilitásának, oldhatóságának és permeabilitásának vizsgálatával kezdődik, majd a sejten belüli PROTAC és az E3 ligáz, illetve a célfehérje közötti bináris kötődésekkel folytatódik, amely kölcsönhatásokat IC50 és Kd értékekkel és más bináris kinetikai és termodinamikai paraméterekkel lehet leírni. Ezek az értékek biofizikai technikákkal, például izotermális titrálási kalorimetria (ITC), fluoreszcencia-polarizáció (FP), felületi plazmonrezonancia (SPR) és bioréteg-interferometria (BLI) segítségével mérhetők meg. Mindeközben az erős bináris kötődések legfontosabb feladata, hogy azok előkészítik a hármas komplex képződését, amelynek optimalizálása és jellemzése a folyamat (egyik) legfontosabb része. A hármas komplex szerkezetének pontosabb megismerése például röntgenkrisztallográfiás szerkezeten keresztül jó támpontot adhat a molekula további fejlesztéséhez. A hármas komplex kialakulását követően várható, hogy a célfehérje ubikvitinálódik és a proteaszómához irányítódik lebontás céljából. Ezeket a folyamatokat különféle biokémiai módszerekkel lehet nyomon követni, beleértve a tömegspektrometriát és a western blot vizsgálatokat, amelyeket ubikvitináció és proteaszóma-inhibitorok jelenlétében is el kell végezni. A hármas komplex kialakulása és a lebontás közötti kapcsolat megállapítása fontos, mivel ez szemlélteti a hármas komplexben résztvevők egymáshoz képesti elhelyezkedését, beleértve a PROTAC geometriáját és a fehérjék egymáshoz viszonyított orientációjának fontosságát, illetve a produktív hármas komplex létrejöttét.

 

 

 

Az Arvinas cég a klinikai fejlesztésben legtovább jutott és jelenleg fázis III-ban lévő PROTAC-molekulája, az ARV-471 az ösztrogén receptorok (ER) lebontását célozza meg az emlőrák kezelésében (3.5.7. ábra A). A vegyület szerkezetalapú kutatás eredményeként született, amelynek során a molekula egésze – az E3 ligázkötő, ER antagonistakötő és a linker – optimalizálások sorozatán ment keresztül. A kezdeti felfedező kutatás során, amikor különböző E3-ligandumokat és ER-kötőket próbáltak ki, a kiválasztott raloxifén ERα-ligandum és VH-032 VHL-alapú PROTAC-molekula jó hatékonysággal bontotta le az ERα-proteint, de orális biohasznosulása nagyon alacsony volt (1). A felhasznált ligázkötő (VHL-kötő) Cereblon E3 ligázligandumra, lenalidomidra történő cseréje lényegesen jobb orális biohasznosulást eredményezett (2). A CRBN-kötő kapcsolódási vektorának módosítása (3), majd az ezt követő ER-ligandum hatékonyabb tetrahidronaftalin-kötőre való cseréje (4) és a linker optimalizálása (5) után jutottak el ahhoz a limitált flexibilitással rendelkező PROTAC-vegyülethez, amelynek a hatékonyabb optikai izomerje került a fejlesztésbe vepdegesztrant (ARV-471, MCF7 DC50 = 1,8 nM) néven (Han, 2022). A vepdegesztrant gyorsan és szelektíven képes az ösztrogénreceptort (ER) (> 80%-ban 4 órán belül) lebontani számos ER+ sejtvonalon, és ugyanolyan hatékonynak bizonyult a klinikailag releváns ligandfüggetlen ER-mutánsokkal szemben is. Preklinikai in vivo modellekben a szájon át naponta egyszer alkalmazott vepdegesztrant több mint 90%-ban lebontotta az ER-t. A vepdegesztrant jelenleg fázis III klinikai fejlesztés alatt áll ER+ helyileg előrehaladott vagy metasztatikus emlőrákban szenvedő nők kezelésében.

 

 

A vepdegesztrant és a klinikai vizsgálatokban részt vevő, orálisan adható PROTAC-molekulák fizikokémiai tulajdonságai jelentősen eltérnek a Lipinski-szabályok (Ro5) szerint az orális gyógyszerek esetében statisztikailag megállapított határértékektől (3.5.7. ábra B és C). Az emberben és három gyakori preklinikai fajban orálisan biohasznosuló PROTAC-ok kísérleti elemzése során azt találták, hogy az oldószerre nyitott hidrogénkötés-donorok (HBD) esetében a határérték drasztikusan alacsonyabb, mindössze 2, szemben az Ro5-ben meghatározott 5 HBD-val. Ezen túlmenően a PROTAC molekuláris polaritása, amely kísérleti ePSA-mérésekkel jellemezhető, javítható mind a HBD-árnyékolásával (belső hidrogénhíd kialakításával), mind az ionos részek módosításával (Schade, 2024). Ezzel együtt elmondható, hogy szájon át adható PROTAC-gyógyszer fejlesztése nagyon nagy kihívás, és eddig csak Cereblon E3 ligázt használó PROTAC-molekulák esetén születtek ilyen klinikai jelöltek. Fontos továbbá megjegyezni, hogy a PROTAC vér-agy gáton való hatékony átjutására sincs kidolgozva jelenleg elfogadott módszer.

 

A korábban bemutatott proteoszomális célzott fehérjelebontási módszerek (PROTAC-ok és ragasztók) mellett számos új, ígéretes, de még kevéssé validált, lizoszomális fehérje lebontási stratégiá létezik. A következő részben olyan lizoszómafüggő TPD-stratégiákat mutatunk be, amelyek membránfehérjék, extracelluláris fehérjék és fehérjeaggregátumok lebontására képesek, így jelentősen kibővíthetik a szubsztrátok lehetséges körét és az eddig gyógyszeresen nem modulálható célpontokat.

A lizoszómacélzott kiméra (LYTAC) olyan új technika, amely az extracelluláris és membránfehérjék lebontását indukálja az endoszóma–lizoszóma útvonalon keresztül. Mivel az extracelluláris és membránfehérjék a humán genom által kódolt fehérjék 40%-át teszik ki, továbbá kulcsfontosságúak a neurodegeneratív és autoimmun betegségek, valamint a rákos folyamatok kialakulása szempontjából, a LYTAC jó kiegészítője a PROTAC-oknak. A LYTAC-molekulák egyszerre képesek kötődni egy membránfehérje extracelluláris doménjéhez vagy egy extracelluláris fehérjéhez és egy lizoszómacélzó receptorhoz (LTR), amely a sejtfelszínen található. A hármas komplex képződése a fehérje internalizációjához vezet klatrinmediált endocitózis révén, és a célfehérje ezt követően lebomlik. Az első irodalmi LYTAC-molekula a kationfüggetlen mannóz-6-foszfát-receptoron (CI-MPR/IGF2R) alapul. A CI-MPR-ok megkönnyítik a lizoszomális enzimek intracelluláris szállítását, amelyeket a mannóz-6-foszfáttal (M6P) lezárt N-glikánok módosítanak. Az alacsony pH a késői endoszómákban a lizoszomális enzimek és a CI-MPR disszociációjához vezet. Míg az előbbi lizoszomális lebontásra kerül, a CI-MPR a sejtfelszínre kerül újrahasznosítás céljából. Ezt a természetes folyamatot használták fel az első LYTAC-molekulák létrehozására, amelyek egy kismolekulát vagy antitestet tartalmaznak, és ezt egy szintetizált CI-MPR-célzó ligandumhoz, a poli-M6Pn-hez kapcsolják. A LYTAC-stratégia ígéretesnek bizonyult több terápiás szempontból releváns fehérje lebontásában is. Ilyen például egy EGFR-antitesthez, a cetuximabhoz konjugált poly-M6Pn-t tartalmazó LYTAC-molekula, amely eredményesen bontotta le az EGFR-t különböző sejtvonalakban (Banik, 2020).