Keserű György Miklós (szerk.)

Gyógyszerkémia

4.2.2. A HTS megvalósításának lépései

A HTS elemei

A nagy áteresztőképességű tesztelés megvalósításához az alábbi elemeknek kell rendelkezésre állni (Wildey és mtsai, 2017; Numao és mtsai, 2022).

Robusztus és releváns biológiai tesztmódszer. HTS-hez ideális egy kevés hibalehetőséget hordozó, robusztus és reprodukálható, érzékeny és farmakológiailag hitelesített, költséghatékony biológiai módszer. A tesztkiválasztás szempontjainak részletes ismertetésére a 4.2.2.1. fejezetben kerül sor.

Megfelelő minőségű vegyülettár. A HTS-tevékenység elválaszthatatlan az akár több millió vegyületet tartalmazó, megfelelően kezelt diverz vegyületgyűjtemény rendelkezésre állásától. A vegyülettár egyedileg azonosított tárolókban, megfelelő körülmények között (hőmérséklet, pártartalom) szilárd és/vagy oldatformában tartalmazza a különböző forrásból – így például korábbi kémiai programokból, vegyületbeszállítóktól, bővítést célzó szintézisekből, természetes anyagok izolálásából – származó mintákat. A mintákhoz hozzárendelt szerkezeti információ tartozik, amelyet egyéb paraméterek, többek közt a rendelkezésre álló mennyiség vagy becsült, illetve mért fizikai kémiai paraméterek is kiegészíthetnek.

Az oldatfázisú vegyülettár kialakítása és tárolása során számos szempontot kell figyelembe venni (Nie, 2010; Gonzales és mtsai, 2021). A vegyülettárakban legáltalánosabban használt szerves oldószeralapú tárolás (dimetil-szulfoxid-oldat) során a tartós párás légkör és a minták ismételt felolvasztása a minták vízfelvételéhez, így a vegyületek bomlásához, kiválásához vezethet. Ezeket a veszélyeket két, alapvetően eltérő eljárással próbálják csökkenteni: egyszer használatos ún. tesztlemezek előállításával, illetve just in time-rendszerű mérőlemez-előállítással. Az első módszernél nagyszámú, azonos elrendezésű és térfogatú lemezmásolat készül a vegyülettárból, így a vegyülettári törzsoldat minimális állapotromlással őrizhető meg. Ennek a megközelítésnek hátránya, hogy a mélyhűtött replikák tárolása nagy kapacitásigényű és rugalmatlan (nem randomizált és adott térfogatú minták) mérési formátumot jelent. A just in time-módszernél a mérőlemezekre akár tesztenként különböző (akár néhány nl) térfogatú mintaoldatok kerülhetnek, itt azonban a vegyülettári törzsoldatok minőségének megőrzése okozhat problémát.

Mivel a mérőlemezeket mindkét módszer esetén a felhasználás idején hígítják a teszttel kompatibilis vizes pufferoldattal a kívánt koncentrációra, az előállításkor a lemezeken a kontrollok céljára üresen hagyott cellák maradnak.

A vegyülettárban elhelyezett kismolekulás mintáktól elvárt a gyógyszerszerű kismolekulák kémiai terének minél hatékonyabb mintavételezése, a megfelelő tisztaság, továbbá, hogy megbízható szerkezeti információ álljon róluk rendelkezésre. Egyes gyógyszergyárak bekerüléskor minden mintát integritás-ellenőrzésnek vagy szerkezeti ellenőrzésnek vetnek alá, de szúrópróbákkal is ellenőrizhetik a tárolás során a minták degradációját.

A tárolt oldatokkal szemben további követelmény, hogy az oldószer, illetve a minták töménysége megengedje a μM-os koncentrációtartományban történő biológiai tesztelést, hiszen már akár 1–2% szerves oldószertartalom jelentősen befolyásolhatja a biológiai célpontként szolgáló fehérjék működését.

A vegyülettárak kezelése tekintetében az elmúlt években előtérbe került a minták tömeges egyedi elérhetőségének fontossága. Ez nemcsak a szűrővizsgálatban azonosított aktívak kigyűjtéséhez nélkülözhetetlen, de a jelenlegi trendek szerint egyre gyakrabban alkalmazott célzott vizsgálatokhoz is, mint a virtuális szűrésben azonosított minták, a HTS-találatok szerkezeti analógjainak, illetve az in silico vagy egyéb szűrésekkel kiválogatott fókuszált vegyületkönyvtárak vizsgálatai. Jelenleg a legnagyobb áteresztőképességet és rugalmasságot ezen a téren azok a mintakezelő és -tároló rendszerek nyújtják, amelyekben a mintákat egyedi, azonosítóval ellátott csövek tartalmazzák. Ezek a rendszerek képesek akár napi 50–100 000 mintát automatikusan kiválogatni, összerendezni és a felhasználó vagy akár robotikus mintakezelő rendszer felé a megadott elrendezésben továbbítani. Az összerendezés, és gyakran a tárolás is, mérőlemezzel megegyező befoglaló méretű, azonosítóval ellátott 96 vagy 384 cső kapacitású keretekben valósul meg (4.2.2. ábra).

Harvard

(): . : . : /hivatkozas/m1334kgyke_1278/#m1334kgyke_1278 ()

Chicago

. . . : . (: /hivatkozas/m1334kgyke_1278/#m1334kgyke_1278)

APA

(). . . (: /hivatkozas/m1334kgyke_1278/#m1334kgyke_1278)

BibTeX EndNote Mendeley Zotero

4.2.2. ábra. Automata mintakezelésre használt tárolócsövek kerettel

Műszeres felszereltség. A HTS-rendszerek kialakítása a komplexitás és a flexibilitás tekintetében különbözhet az egyféle tesztre specializáltan kialakított munkaállomásoktól egészen a többféle leolvasást és folyadékkezelési lépést lehetővé tevő integrált rendszerekig (Zheng és mtsa, 2010; Wildey és mtsai, 2017). Ennek megfelelően megkülönböztethetünk részben vagy teljesen automatizált munkaállomásokat és teljesen automatizált robotikus rendszereket. Részleges automatizálás esetén a lemezek feldolgozása kötegelt módon, adagokban folyik, a lemezek mozgatása pedig manuálisan vagy egyszerűbb robotkarok, illetve futószalagok segítségével valósul meg, amit gyakran a készülékekhez illeszthető stacker (néhány tucat lemezből álló „torony” kezelésére alkalmas) robotok támogatnak. A következő szintet az egyszerűbb lineáris robottal felszerelt központi automata köré telepített munkaállomások képviselik, amelyek előre meghatározott műveletsorok teljes automatizálását teszik lehetővé (4.2.3. ábra). Végül a teljesen automatizált rendszerekben központi, általában SCARA- vagy artikulált robotkarok szolgálják ki a moduláris felépítésű eszközparkot. Egy ilyen rendszer kialakítása költséges, működtetése pedig speciális szakértelmet igényel, azonban a telepített eszközök korlátain belül flexibilisen teszi lehetővé akár igen összetett műveletsorok automatizálását is.

Harvard

(): . : . : /hivatkozas/m1334kgyke_1281/#m1334kgyke_1281 ()

Chicago

. . . : . (: /hivatkozas/m1334kgyke_1281/#m1334kgyke_1281)

APA

(). . . (: /hivatkozas/m1334kgyke_1281/#m1334kgyke_1281)

BibTeX EndNote Mendeley Zotero

4.2.3. ábra. Automatizált robotikus mérőrendszer

Az automatizálás módjai közti különbség a műveletvégzési stratégiát és az elkövethető hibát is érintheti. Kötegelt vagy adagokban történő feldolgozás során az egyes műveleti lépések mérőlemezek csoportjaira egyszerre kerülnek megvalósításra. Ebben az esetben nem okoz jelentős problémát a reagensek instabilitása, azonban az inkubálások ideje és körülményei nem tarthatók azonosan, a tesztnek ezeket az eltéréseket tolerálnia kell. A központilag vezérelt, teljesen automatizált lemezmozgatás során ezzel szemben a műveletsor időzítetten kivitelezhető, ami az eszközöket vezérlő ütemező szoftver programozásán keresztül érhető el. Itt a reagenseknek megfelelő időbeli stabilitást kell mutatniuk, az inkubálás körülményei és ideje viszont adott korlátok közt viszonylag pontosan tartható.

A nagy áteresztőképességű szűrés hatalmas mintamennyiségéből adódóan a minták, reagensek tömegmérése gyakorlatilag nem alkalmazható, ezért a minták, reagensek kezelése és bemérése térfogatméréssel, célszerűen folyadékformában történik. A tesztelés során így rendkívül fontos a megfelelő folyadékkezelési technológiák használata. A reakció-térfogatok néhány μl-es mérettartományba csökkentése szükségessé tette a kis térfogatban is jól reprodukálható és pontos folyadékadagolási technikák kifejlesztését. A μl-es tartományban legelterjedtebb a levegő-kiszorításos elven működő hagyományos többcsatornás dugattyús pipetták (eldobható műanyag- vagy tisztítható fémhegyekkel) és perisztaltikus adagolók használata (4.2.4. ábra), a nl–μl tartományban azonban az ún. pin tool eszközök (folyadéktranszfer speciális fémtű hegyén), pozitív kiszorítású adagolók és az akusztikus rezonancia kiváltotta cseppkilövellésen alapuló eszközök bizonyultak a leghatékonyabbnak (Wildey és mtsai, 2017). Ez utóbbi technológia számos előnyénél fogva jelentős technológiai előrelépést jelentett. Rendkívül kis térfogatban, még száraz edénybe is képes pontos adagolást megvalósítani érintkezés és fogyóeszköz felhasználás nélkül, ami nem csak költséghatékony miniatürizált esszék kivitelezését, de eseti alkönyvtárak összeállítását is támogatni tudja (Griffith és mtsai, 2012; Dawes és mtsai, 2016).

Automatizált környezetben a fáziselválasztási lépések során szükséges folyadékeltávolítás a legkevésbé megbízható művelet. Itt az elszívócsövek, szűrőfelületek eltömődése a leggyakoribb hibaforrás, ami intenzív karbantartás és ellenőrzés mellett is rendszeresen felléphet, ezért 384 és 1536 cellás lemezek esetében kerülendő az ilyen eszközök használata. Kereskedelmi forgalomban hozzáférhetők szűrőfelülettel rendelkező 96 és 384 cellás mikrolemezek, az automata lemezmosó (tehát folyadékadagolást és -eltávolítást is végrehajtó) készülékek pedig akár 1536 cellás lemezeket is képesek kezelni.

Harvard

(): . : . : /hivatkozas/m1334kgyke_1286/#m1334kgyke_1286 ()

Chicago

. . . : . (: /hivatkozas/m1334kgyke_1286/#m1334kgyke_1286)

APA

(). . . (: /hivatkozas/m1334kgyke_1286/#m1334kgyke_1286)

BibTeX EndNote Mendeley Zotero

4.2.4. ábra. 8 csatornás automata perisztaltikus adagolókészülék

Automatizált körülmények közt a mintalemezek azonosítása vonalkódok segítségével történik, ami lehetővé teszi az egyes lemezek mérési adatain kívül a vonatkozó tesztparaméterek rekonstruálását is.

Számítástechnikai támogató rendszer. A nagyszámú sorozatmérés megbízható megvalósításához a megfelelő információtechnológiai háttér biztosítja az adatok azonosítható tárolását, és ezekből a minőség-ellenőrzést szolgáló paraméterek és a tesztelt mintákhoz tartozó aktivitások meghatározását. A számítástechnikai háttér teszi lehetővé a robotizált tesztek egységes megvalósítását, és rögzíti a futás közben automatikusan észlelhető hibákat. Az adatok egyszerű kezelése és összerendelése relációs adatbázis-kezelők segítségével (pl. Oracle, mySQL, Postgres) valósítható meg. Az adatbázis-kezelő rendszerek képesek a mérés során keletkező információk (leolvasott adatfájlok, vonalkód-beolvasások) valós idejű és kötegelt feldolgozására is. Ezenfelül az SQL-alapú programozási nyelvek hatékonyan megvalósíthatóvá teszik a kiértékelés során alkalmazott dekonvolúciós vagy korrigáló algoritmusokat is (lásd 4.2.2.3. fejezet).

Humán erőforrás. A HTS az ipari és akadémiai kutatás különleges szakmai hátteret igénylő, erősen határterületeken működő diszciplínája. Ellátásában biológiai, kémiai, információmérnöki és automatizálási ismeretekre van szükség, ezért nem meglepő, hogy általában interdiszciplináris csapatok részvételével valósítják meg (Houston és mtsai, 2008).

Tartalomjegyzék

Kiadó: Akadémiai Kiadó

Online megjelenés éve: 2026

ISBN: 978 963 664 145 0

Kémia

A kötet az Akadémiai Kiadónál 2011-ben Gyógyszerkutatás kémiája címen megjelent kézikönyv hagyományaira alapozva a kismolekulás gyógyszerkutatás eszköztárára és módszertanára fókuszál. Újdonságot jelent a magyar nyelvű szakirodalomban, hogy a modern gyógyszerkémiai felfogásnak megfelelően nem pusztán a meglévő gyógyszerkincs kémiáját mutatja be, hanem betekintést enged a kismolekulás gyógyszerek felfedezésének stratégiájába is.

Hivatkozás: https://mersz.hu/keseru-gyogyszerkemia//

BibTeX EndNote Mendeley Zotero