Miniatürizálhatóság. A tesztet legalább 96 cellás mérőlemezen reprodukálható módon kell tudni megvalósítani, de előnyös, ha a tesztreakció ennél kisebb térfogatban is kivitelezhető. A térfogat csökkentése azonban jelentős fajlagosfelület-növekedéshez, és így a felületi jelenségek szerepének növekedéséhez vezet, ezáltal például kötődési és enzimkinetikai mérések esetében befolyásolhatja a reakciók időbeli lefutását.

Automatizálhatóság. A teszt protokollja célszerűen legyen egyszerű, lehetőleg ne tartalmazzon elválasztási lépést és széles tartományban tolerálja az inkubálási körülmények (hőmérséklet, idő, fényerő, páratartalom) változását. A teszt leolvasási időtartamának megfelelően rövidnek kell lenni az áteresztőképesség fenntartásához (kinetikus leolvasásokkal szemben a végpontleolvasások előnyt élveznek).

Megbízhatóság. A teszt jel/háttér és jel/zaj viszonya legyen magas (jel/háttér esetén a 3, jel/zaj esetén a 10 az irányadó érték), és az eredmények legyenek reprodukálhatóak.

Farmakológiai relevancia. A detektált jelenség legyen a megcélzott hatásmechanizmus szempontjából releváns (kötődési teszt a megfelelő kötőhelyre, receptor megfelelő jelátviteli útjának vizsgálata, szubsztrátlimitáció kompetitív enziminhibitor keresésénél).

Farmakológiai hitelesség. A tesztet a rendelkezésre álló farmakológiai eszközök segítségével hitelesíteni kell. Modulátoroknak a megfelelő irányú hatást kell kiváltaniuk, hatékonyságuknak és hatáserősségüknek pedig kis nagyságrendbeli eltéréssel, az irodalmi értékekkel összehasonlítható sorrendet kell mutatni. A célpontra specifikus referenciavegyület hiányában a kiolvasott jel valamely aspecifikus perturbátora is használható jelablak meghatározására.

Oldószertűrés. A tesztnek viszonylag magas szerves oldószer-koncentrációt kell tolerálnia. A vegyülettárak leggyakoribb szerves oldószere a dimetil-szulfoxid (DMSO), de etanol, sőt, természetes eredetű mintáknál akár a mintapreparálás oldószermaradványai is jelen lehetnek a reakciótérben.

Érzékenység. A nagy áteresztőképességű teszttel szemben állított egyik legfontosabb követelmény a megfelelő érzékenység, hiszen a kémiai tér tökéletlen mintavételezése miatt a tesztben gyakran alacsony hatáserősségű, akár μM-os koncentrációtartományba eső IC50/EC50 értékekkel jellemezhető hatást kell megbízhatóan kimutatni. Ez egyes módszerekben, például fluoreszcencia-anizotrópia mérésekben, magas szubsztrátkoncentráció esetében enzimkinetikai reakció tesztekben vagy intracelluláris célpontok elő sejtekben történő vizsgálatánál jelenthet nehézséget.

Alacsony mintainterferencia. Különösen fotolumineszcenciás spektroszkópiai detektálások során lehet zavaró az ismeretlen szerves kismolekulák interferenciája (fluoreszenciakibocsátás, fényelnyelés). Az interferenciát arányalapú leolvasást (pl. két hullámhosszon mért fluoreszcenciaintenzitás aránya) vagy időfüggő leolvasást (pl. késleltetett fluoreszcenciaintenzitás-mérés) alkalmazó detektálási technikákkal lehet csökkenteni.

Munkaegészségügyi és hulladékgazdálkodási szempontok. A HTS kezdeti korszakában gyakoriak voltak a radiokémiai detektálások. Ezek munkaigényes voltuk mellett (elválasztási lépések) hulladékgazdálkodási és hatósági szempontokból is kevéssé preferáltak. Hasonlóan korlátozó lehet például az alacsony megvilágítás mellett használandó, különösen fényérzékeny reagensek tartós használata.

Kötődési és funkcionális tesztek. Kötődési tesztek során kismolekulás ligandumok vagy makromolekuláris partnerek (peptid, fehérje, RNS, DNS) kötődése mutatható ki közvetlen vagy közvetett úton (leszorításos tesztek). Funkcionális tesztben a biomolekula–ligandum kölcsönhatás hatása vizsgálható funkcióváltozáson keresztül, például receptoraktiváció vagy antagonizmus, enzimaktiváció vagy -inhibíció.

Hatásmechanizmus. Funkcionális tesztekben a hagyományos agonista/aktivátor, illetve antagonista/inhibitor tesztek mellett egyéb hatásmechanizmusok is vizsgálhatók. Ilyen a receptorok allosztérikus modulálása (pl. potencírozás), fehérje–fehérje vagy fehérje–DNS kölcsönhatások befolyásolása, egyéb fenotípusváltozások (pl. sejtalakváltozás, apopotózis, fehérjetrafficking vizsgálata HCS-módszerrel) vagy az onkológiai területen széles körben használt citotoxicitás tesztek.

Izolált célpont vagy sejtszintű folyamat vizsgálata. Izolált célpont esetében fehérjeizolátum, membránpreparátum, sejtlizátum szolgál a megcélzott biomolekula forrásául, ami általában a kontrollált mennyiségű, egyenletes minőségű célpont előnyeit hordozza. Élő sejtes vizsgálatokban ezzel szemben a célmolekula biológiai környezetbe ágyazva, kölcsönhatások hálózatában tud működni, és így a szupramolekuláris komplexekben zajló folyamatok, például ioncsatornák vagy receptorok működése vizsgálhatóvá válnak. Ezekben az esetekben nehézség lehet az állandó minőségű célpont biztosítása és az, hogy jelentős különbség lehet a fehérje natív és rekombináns intracelluláris környezete között, továbbá, hogy a sejtmembrán permeabilitása a főhatástól függetlenül korlátozza a vegyületek bejutását.

A detektálás módja. A tesztek biológiai sokoldalúságát a detektálási módok sokasága egészíti ki. Megkülönböztethetünk jelöléses és jelölésmentes módszereket. Utóbbiakban a jelenség vagy az analit jelölt külső komponens nélkül vizsgálható, például tömegspektroszkópiával, elektrofiziológiával vagy fluoreszcencia-spektroszkópiával, míg előbbiekben specifikus reagenst (indikátor, ellenanyag, jelölt ligandum, kimérafehérje, kapcsolt enzimreagensek) használnak a jel előállítására.

A jelöléses, tipikusan spektroszkópiai technológiák részletes ismertetésétől most eltekintünk; legfontosabb megemlítendő vonásuk a fáziselválasztási lépés szükségességét érinti. A homogén proximitás detekcióján alapuló módszerekben általában híg oldatokban két komponens fizikai közelsége által kiváltott jelet detektálunk. Az elválasztás nélküli radioaktív detektálás során például gyöngyök formájában, illetve bevonatként alkalmazott szcintillátorok segítségével próbálják fokozni a jel specificitását, a nem radioaktív technológiák közül pedig elterjedtek a Förster-féle rezonancia-energiaátadás (FRET), a hosszú fluoreszcencia-élettartamú lantanidadonort alkalmazó időfüggő FRET- (time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET), a fénystimulált lumineszcencián alapuló Alphascreen-, illetve a lumineszcens fehérjékre vagy fehérjefragmensekre épülő biolumineszcencia-rezonanciaenergia-transzfer- (BRET) vagy a fluoreszcencia-anizotrópiát felhasználó módszerek.

Ismert reakciókat katalizáló enzimek, ligandumkötődési és fehérje–makromolekula kölcsönhatások esetén mind az analitok (szubsztrát vagy termék, pl. ATP, ADP, cAMP, hasítási termék, foszforilált fehérje vagy peptid), mind a fehérje–makromolekula (pl. fehérje–fehérje) kapcsolatok jól vizsgálhatóak jelölt ellenanyagon vagy kimérafehérjén alapuló proximitásdetekciós módszerekkel vagy jelölt ligandumokkal. A differenciális pásztázó fluorimetria (differential scanning fluorimetry, DSF), annak jelöltetlen fehérjéket használó (nanoDSF) vagy sejtes fajtája (cellular thermal shift assay, CETSA) a fehérjék hőstabilitását vizsgálva használható kötődés kimutatására, az affinitásszelekciós tömegspektroszkópia (affinity selection mass spectrometry, ASMS) pedig vegyületkeverékek közül képes elválasztást követően a kötődő komponensek azonosítására. Katalitikus hatás nélküli vagy ismeretlen működésű fehérjecélpontok vizsgálatára az utóbbi módszerek különösen alkalmasak lehetnek.

A HTS egyik legáltalánosabban használt élő sejtes módszere a receptoraktivációt vagy ioncsatorna-nyitást követően megváltozó intracelluláris kalciumszint kinetikus fluorimetriás vizsgálata, de a legkülönbözőbb intracelluláris komponensek és folyamatok (riportergén transzkripciója, másodlagos hírvivő molekulák koncentrációváltozása, metabolikus vagy fehérjefoszforilációs állapotváltozások) is vizsgálhatóak az előző pontban leírt módszerekkel. Az ioncsatornák által közvetített membránpotenciál-változások vagy ionáramok pedig a sejthártyán keresztül töltésfüggő eloszlást mutató fluoreszcens festékekkel vagy az elmúlt évtizedben továbbfejlesztett, akár 384 csatornás, automata patch-clamp-módszerrel vizsgálhatóak. Végül az automatizált mikroszkópos detektálás által lehetővé vált HCS (High Content Screening) érdemel említést, amely módszerrel szinte bármilyen, standardizáltan számszerűsíthető sejtszintű paraméter (sejtalak vagy méret, fluoreszcenciaintenzitás-eloszlás, granularitás) vizsgálható, ami munkaigényes volta ellenére ideális módja komplex, párhuzamos celluláris folyamatok vagy magas komplexitású sejtes rendszerek fenotípusos vizsgálatának.