Keserű György Miklós (szerk.)

Gyógyszerkémia

4.2.2.3. A HTS-kampányok megvalósítása

A nagy áteresztőképességű szűrés kivitelezésének körülményei értelemszerűen megfelelnek az adaptálás során meghatározott paramétereknek. A valós, akár heteken át futó HTS-kampányok során további három téren léphetnek fel jelentős kihívások: a reagensellátás, a minőség-ellenőrzés és az adatkezelés területén.

A HTS-kampány logisztikája

A HTS-kampány során igen nagy mennyiségű minta gyors és megbízható mérése zajlik, ami elsősorban a reagensellátással kapcsolatban jelent kihívást. Legfontosabb a megfelelően intakt biológiai minta biztosítása, ami élő sejteket és funkcionálisan intakt fehérjéket is jelenthet. Izolált fehérjék esetében a megfelelő stabilitást és homogenitást biztosító tárolási körülmények, majd a stabilitási időtartam lejártával friss preparátum biztosítása a feladat. Sejtkultúrák esetében a sejtek futási időtartam alatt bekövetkező életképességi, funkcionális vagy egyéb fenotípusos változásait minimalizálni kell, amit elsősorban a cellánkénti sejtsűrűség minél egyenletesebb értéken tartásával próbálnak elérni. A hosszas, akár napi 24 órában futó kampányok során naponta több, eltérő cellánkénti sejtszámmal szélesztett mikrolemezadagot állíthatnak elő, ami csökkenti, de nem szünteti meg a lemezek közti trendszerű változást. Kémiai vagy fizikai úton szaporodásképtelenné tett, de intakt fehérjét kifejező sejtek használatával ez az eltérés teljes mértékben megszüntethető.

HTS és egyéb nagy léptékű mikrolemez-alapú mérések során gyakorlatban van az a módszer, amelynek során a sejteket folytonosan fenntartott kultúra helyett fagyasztott állapotban a tárolásból azonnal mikrolemezre szélesztik. Ezzel a módszerrel folytonos sejttenyésztés nélkül, egyenletes minőségű sejtek használhatók fel, amelyek mennyiségét csupán a mélyfagyasztási kapacitás korlátozza.

A HTS-kampány minőségellenőrzése

A HTS-futás során nélkülözhetetlen a teszt minőségének folytonos ellenőrzése. Mivel az egyes mikrolemezek pontos reakciókörülményei (reagensek minősége, inkubálási idő) eltérőek lehetnek, ezért a detektált tesztreakció minőségét számszerűsítő paramétereket minden egyes lemezre meg kell határozni.

Mivel a tesztreakció minősége a mérőlemez összes cellájában nem határozható meg, a lemezen várható reakcióminőséget kontrollcellák segítségével jellemzik. Az oldószerkontroll a vegyületminták hígításából származó maradékoldószer hatását szimulálja, a pozitív kontroll pedig a szűrővizsgálatban vizsgált jelenség maximális mértékét jelöli ki reprodukálható módon. Erre a szakirodalomból ismert vegyület, esetleg természetes eredetű anyag használható, kiválasztásakor azonban a hatáserősségen és hatékonyságon kívül egyéb szempontok (pl. hatásmechanizmus, reprodukálhatóság, stabilitás oldatfázisban) figyelembevétele is ajánlott. Esetenként szubmaximális hatású, részleges pozitív kontroll is a lemezekre kerülhet, ez a teszt érzékenységére és a részleges hatású, általában nagyobb varianciájú minták szórására ad becslést.

A kontrollokat főként tartós tesztelés során a rendszer stabilitásának és homogenitásának vizsgálatára is használják. Ilyenkor a vegyülettári lemezeket, adott gyakorisággal, több referenciakontroll koncentrációsorát vagy a maximális jelet kiváltó kontrollt tartalmazó mintalemez követi, ami a referenciavegyületek IC50/EC50 értékének stabilitására, illetve a tesztreakció homogenitására szolgáltat becslést a valós futás körülményei között. Ezek a mérési eredmények később korrekciók alapjául szolgálhatnak.

A kontrollcellák adatai alapján meghatározott minőség-ellenőrzési paraméterek egyik része a tesztreakció mértékét jelzi, tehát azt, hogy milyen mértékben változott meg a vizsgált (általában spektroszkópiai) tulajdonság az adott körülmények között (jel/háttér arány, jelablak – signal window, SW). A jel precizitását a jel/zaj arány és a populáció variációs koefficiense (CV) jellemzi. Ez a két mérőszámcsoport azonban nem vagy kevéssé veszi figyelembe a magas jelű elemek (gyakran a populáció nagyobb részét adó, a teljes reakciót nem gátoló minták) szórását a jelablakhoz képest. Ezt a hiányt specifikusan HTS-alkalmazásokra kidolgozott statisztikai mérőszámok próbálják pótolni. Ilyenek a tesztvariabilitási arány (assay variance ratio, AVR), a minimum szignifikáns arány (minimum significant ratio, MSR) (Eastwood és mtsai, 2006), de legelterjedtebb az ún. Z’ paraméter (Zhang és mtsai, 1999; Iversen és mtsai, 2006):

ahol σc+ és σc– a pozitív és negatív kontrollcellák aktivitásadatainak varianciája, μc+ és μc– pedig a megfelelő kontrollcellák aktivitásadatainak átlagértéke.

A Z’ paraméter használata ellenőrzési kritériumként (általában Z’ > 0,4–0,5) általánosan elfogadottá vált a HTS-alkalmazások szolgáltatta adatok minőségének jellemzésében és biztosításában. A módszer hátránya, hogy kevéssé alkalmas a farmakológiai különbségek (pl. affinitás- vagy hatáserősség-változás) feloldására és az automatizálással járó szisztematikus hibák kimutatására. A fenti ellenőrző paraméterek használata mellett mind a HTS-futás közben, mind azt követően szükséges a keletkező adatkészlet szemrevételezése. Az adatok mérőlemezenként és pozíciónként történő megjelenítése, az aktívok arányának változása a korábban ismertetett paramétereknél érzékenyebben jelezheti a futás során előálló automatizálási hibákat vagy a teszt szolgáltatta adatok minőségének változását (4.2.9. ábra).

Harvard

(): . : . : /hivatkozas/m1334kgyke_1348/#m1334kgyke_1348 ()

Chicago

. . . : . (: /hivatkozas/m1334kgyke_1348/#m1334kgyke_1348)

APA

(). . . (: /hivatkozas/m1334kgyke_1348/#m1334kgyke_1348)

BibTeX EndNote Mendeley Zotero

4.2.9. ábra. HTS-aktivitásadatok mérőlemezenkénti áttekintő megjelenítése

Forrás: saját szerkesztés

A HTS-adatkészlet kezelése

A HTS során nyert aktivitásadatok a korábban ismertetett adatbázisba kerülnek. A lemezazonosítók és a lemezen belüli pozíciók alapján az egyes mintákhoz a tesztnek megfelelő kiértékeléssel, a teszt adott lemezen megtalálható negatív és pozitív kontrolljainak értéke alapján meghatározzák a minta aktivitását. Ez az érték általában normalizált módon fejezi ki az adott minta jelenlétében lezajlott tesztreakció, illetve hatás mértékét.

Tartalomjegyzék

Kiadó: Akadémiai Kiadó

Online megjelenés éve: 2026

ISBN: 978 963 664 145 0

Kémia

A kötet az Akadémiai Kiadónál 2011-ben Gyógyszerkutatás kémiája címen megjelent kézikönyv hagyományaira alapozva a kismolekulás gyógyszerkutatás eszköztárára és módszertanára fókuszál. Újdonságot jelent a magyar nyelvű szakirodalomban, hogy a modern gyógyszerkémiai felfogásnak megfelelően nem pusztán a meglévő gyógyszerkincs kémiáját mutatja be, hanem betekintést enged a kismolekulás gyógyszerek felfedezésének stratégiájába is.

Hivatkozás: https://mersz.hu/keseru-gyogyszerkemia//

BibTeX EndNote Mendeley Zotero