Találatnak általánosságban három feltétel teljesülése esetén nevezünk egy vegyületet: hatása az alkalmazott tesztben reprodukálható, a hatás nem jelentkezik egy specificitást ellenőrző vizsgálatban és a vizsgált vegyületminta magas tisztasággal a várt vegyületet tartalmazza (oldatintegritás).

A találatazonosítás első lépése az aktivitás megerősítése. Ennek során az összes, a korábbiak szerint kiválasztott lehetséges találat kigyűjtésre kerül a vegyülettárból. Ez a folyamat, amely rendkívül nagy mintaméret vagy aktív arány esetén minták tízezreinek a kigyűjtését jelentheti, még automatizált mintakezelés esetén is igen nagy erőforrás-igényű lépés, amely akár a szűrőkampány szűk keresztmetszete is lehet. A kigyűjtött és megfelelő azonosítással ismét mikrolemez-formátumba rendezett aktívak a HTS során alkalmazott tesztben, az eredeti HTS-méréssel azonos koncentrációban, ismétlésekben és lehetőleg több független kísérletben kerülnek megerősítésre. A megerősítés feladata az automatizálásból eredő hibák (eldugult adagolófej, kémiai átszennyeződés vagy bomlás, folyadékkezelési pontatlanság, detektálási áthallás vagy inhomogenitás) korai eliminálása, vegyületkeverék-könyvtár szűrése esetén pedig az aktív komponens azonosítása.

Az így megerősített aktívakat korábban elsősorban csak sejtes tesztek esetén, de manapság már általánosan specificitás ellenőrzésének vetik alá. Ebben a lépésben a megcélzott célponttól függetlenül (például másik fehérjén vagy sejtvonalon), azonos módszerrel, azonos koncentrációban vizsgálják meg a detektált jelre kifejtett hatásukat, ezáltal kizárva a nyilvánvalóan aspecifikus (például a vizsgált analittal vagy detektálási reagenssel inteferáló, toxikus, denaturáló hatású, spektroszkópiai interferenciát mutató vagy szervetlen katalizátorral szennyezett) mintákat. Az elmúlt évtizedben intenzív vita folyt az elsőfajú hibát jelentő reaktív, aspecifikus interferenciát vagy perturbációt okozó szerkezeti elemek in silico előrejelzéséről. A legszélesebb körben a PAINS (pan-assay interference compound) alszerkezetalapú szabályrendszer terjedt el, de a gyógyszergyárak belső elemzései a különböző szabályrendszereket csak részben hasznosíthatónak találták (Chakravorty és mtsai, 2018; David és mtsai, 2019). A legcélszerűbbnek szűrőfeltételként ezért a találatazonosításnál használthoz hasonló módszeren alapuló, de a célponttól független in vitro interferenciatesztek (counterscreen – ellenesszé) használata bizonyult, az egyes szerkezetekre vagy akár egész találatcsaládokra vonatkozó alszerkezetalapú figyelmeztetések figyelemmel követése mellett (Tan és mtsai, 2024).

Végül ideálisan legalább HPLC/MS-vizsgálattal ellenőrzik a minták egységességét és azonosságát. Elsődleges a főkomponens tömegének azonosítása, míg a tisztasági kritérium függhet az eredeti minta tisztaságától, illetve a szennyezési profiltól.

A fenti vizsgálatsor végén kapjuk a HTS elsődleges eredményét, a célponton ható, megfelelő tisztaságú, várttal azonos szerkezetű megerősített aktívakat, a találatokat.

 

A kémiai csoportosítást fizikai kémiai becslések (lipofilitás, vizes oldhatóság, lásd 4.7.3.1. fejezet), szintetikus kémiai (szintetikus változtathatóság) és gyógyszerkémiai elemzés (membránpermabilitási képesség, lásd 4.7.3.2. fejezet, metabolikus sebezhetőség, lásd 4.7.3.3. fejezet, potenciális toxikus csoportok jelenléte), a kölcsönhatási potenciál felmérése (molekulaméret, az aktívak aránya a hasonló szerkezetű vegyületek körében) és iparjogvédelmi vizsgálat követi. Ebben a szakaszban célszerűen elvetik a fenti szempontok alapján szuboptimális kémiai családokat (lásd például Wellner és mtsa, 2016).

A fennmaradó családok hiteles összehasonlíthatóságához azokat alapos vizsgálatoknak vetik alá. Meghatározzák a vegyületek hatásának koncentrációfüggését, szelektivitását – lehetőleg a HTS-ben alkalmazottól eltérő detektálási elven működő tesztekben. Ebben a szakaszban célszerű affinitáson alapuló szűrés esetén a találatsorozatok elvárt funkcionális hatásának az ellenőrzése, általánosságban pedig lehetőség szerint biofizikai módszerrel a találatok célponttal való kölcsönhatásának igazolása. A találatcsaládok teljes jellemzésének emellett közvetlen kémiai környezetük további vizsgálata is részét képezi. Ennek oka a HTS-vegyülettárak korábban ismertetett korlátozott kémiai mintavételezése: az egyes találatsorozatok között az aktivitáson kívül egyéb szempontokból – molekulaméret és így kölcsönhatási potenciál, a vegyületcsalád képviselőinek száma és azok kémiai tulajdonságai – jelentős különbségek állhatnak fenn.

A találatcsaládok hitelesítéséhez (hitvalidálás) elengedhetetlen legalább néhány képviselő esetében ismert összetételű, tiszta és igazolt főkomponenstartalmú mintákkal ellenőrizni az eredeti oldatmintákkal megfigyelt főhatást. Emellett, különösen alacsony tagszámú családok esetében, szükséges célzott vegyületszintézissel vagy -vásárlással kibővíteni a találatcsaládot (hit expansion).

 

Ehhez az aktivitás mellett a molekulaméretet (kémiai változtathatóság) és a számított vagy mért lipofilitást, mint a nehezen optimalizálható, nem gyógyszerszerű kémiai tulajdonságokkal és promiszkuus biológiai profillal (off-target-hatásokkal) kapcsolatot mutató paraméter,t szokás figyelembe venni. Az irodalomban számos mérőszám jelent meg, amely ezeket a paramétereket figyelembe veszi, ilyen az előző fejezetben megismert ligandumhatékonyság (LE), a lipofilligandum-hatékonyság (LLE) és a ligandumhatékonyság-függő lipofilitás (LELP).

Ezek a paraméterek a találatok jellemzésének szakaszában iránymutatást adhatnak az optimalizálás szempontjából legmegfelelőbb kémiai kiindulópont kiválasztásához.