A szűrési technika és annak áteresztőképessége alapvetően meghatározza a fragmensmolekulák jellegzetességeit és a könyvtár méretét. A fragmensek szűrésére leggyakrabban alkalmazott biofizikai módszerek, a fehérje röntgendiffrakció és az NMR áteresztőképessége limitált és a szűrés nagyon magas (millimoláris) koncentrációban történik. A limitált áteresztőképesség következtében a fragmenskönyvtárnak kicsinek kell lennie, ami valószínűleg gyengén kötődő fragmenstalálatokat (friteket) eredményez. A gyenge találatok nagy szűrési koncentrációt igényelnek, ez pedig fokozottan jó oldhatóságot és ennek következtében erősen hidrofíl karaktert követel meg a szűrt molekuláktól. Hidrofil, vízben nagy koncentrációban oldódó kis molekulatömegű molekuláktól azonban nem várható, hogy biokémiai tesztekben jelentős aktivitást mutassanak (4.3.3. ábra). Ez a gondolatsor a gyakorlatban is megerősítést nyert, mivel a röntgen- vagy NMR-módszerrel azonosított kismolekulás fragmenstalálatok biokémiai tesztekben általában inaktívak, vagy csak nagyon gyenge (IC50 > 0.5 mM) aktivitást mutatnak. Hagyományos biokémiai vizsgálatokon alapuló szűrés mikromoláristól akár elvileg millimoláris koncentrációig is történhet, de ugyanakkor a potenciális ligandumok az emelkedő koncentrációval egyre több nehezen értelmezhető jelenséget adhatnak.

 

A nagyobb áteresztőképesség ugyanakkor lehetővé teszi kiterjedtebb fragmenskönyvtárak szűrését is, ami a jobb mintavételből következően nagyobb valószínűséggel eredményezhet erősebben kötődő találatokat. A nagyobb aktivitású fragmenstalálatok alacsonyabb szűrési koncentrációt is lehetővé tesznek, így a megkívánt oldhatóság és a hidrofil karakter is csökkenthető. Az alacsonyabb szűrési koncentráció azért is előnyös, mert minél alacsonyabb a kismolekula koncentrációja, annál kisebb a valószínűsége annak, hogy a tesztben nemkívánatos módon viselkedjen, illetve hamis pozitív jelet adjon. A szükséges oldhatóság és a hidrofil karakter csökkenése azt eredményezi, hogy a fragmensmolekulák kiegyensúlyozottabb tulajdonságokkal rendelkezhetnek, ami biokémiai környezetben jelentősebb biológiai aktivitást is lehetővé tesz (4.3.4. ábra).

 

 

A fragmensek tervezését jelentősen egyszerűsítette a 2003-ban javasolt „rule of 3” vagy rövidítve „RO3” szabályrendszer, ami a már régóta alkalmazott Lipinski által javasolt „rule of 5” mintájára (lásd 4.7.3 fejezet) egyszerű paraméterek bevezetése mellett érvel a fragmensek szűrésre való alkalmasságának eldöntésére (Congreve és mtsai, 2003). Az RO3 legfontosabb szabályként a molekulatömeg 300 Da-ban, a hidrogénkötés-donorok és -akceptorok számát 3-ban, valamint a logP-t is 3-ban maximalizálja. Ezenkívül a szerzők javaslatot tettek arra is, hogy a forgatható kötések számát is érdemes 3 alatt tartani, valamint a topológiai úton számított poláris molekulafelszín (tPSA) 60 Å2-nál lehetőleg ne legyen nagyobb. Publikálása óta az RO3-szabályrendszer a fragmensmolekulák kiválasztásának alappillérévé vált, és szinte minden, a kereskedelemben beszerezhető, illetve házon belül összeállított fragmenskönyvtár megfelel ezeknek a kritériumoknak. Az RO3-nak van azonban néhány gyenge pontja, amit a fragmenskönyvtár összeállítása során érdemes szem előtt tartani. A fragmensek kiválasztásának Hann által publikált elméleti alapja nem a molekulaméret és a sikerarány közötti összefüggésre hívta fel a figyelmet, hanem a molekula bonyolultsága (szerkezeti komplexitása) és a sikerarány közötti fordított viszonyra. Bár a molekulatömeg a komplexitással áttételesen kapcsolatba hozható, ez az összefüggés nem mindig, nagy atomtömegű atomok esetén pedig általában nem érvényesül. A halogénatomok (leginkább a klór és a fragmensek esetében alkalmanként előforduló bróm) fontos szerepet játszanak a gyógyszerkémiában, de nagy atomtömegük miatt a molekulatömeg-alapú szűrésben a halogéntartalmú molekulák büntetetté vállnak, fajlagos gyakoriságuk ezáltal csökken. A metilcsoport molekulatömege 15 Da, míg a hozzá hasonló méretű klóratomé 35,5 Da. A közel 20 Da-os különbség jelentős előnyt biztosít a metilcsoportot tartalmazó molekuláknak a klórozottakkal szemben, pedig a két csoport összetettsége és biológiai kölcsönhatásokban általában betöltött szerepe is azonos. Hasonló helyzet áll fenn a kéntartalmú vegyületek esetében is, ahol a kén nagy atomtömege például a kéntartalmú heterociklusos, illetve a szulfonamid-csoportot tartalmazó molekulákat bünteti. Ezt elkerülendő helyesebb a komplexitást a molekulatömeg helyett inkább a nem hidrogénatomok (nehéz atomok) számával korlátozni. Ezt könnyen megtehetjük, mivel egy nehéz atom átlagosan kb. 13,3 Da-nal járul hozzá a molekulatömeghez (Hopkins és mtsai, 2004). Így az RO3-szabályban szereplő 300 Da-os molekulatömeg-határ könnyen 22 nehézatom-határra fordítható át, amit a molekulatömeghez hasonló egyszerűséggel lehet számítani, illetve szabályozni. A molekula poláris jellegét befolyásoló értéket, a lipofilitást az RO3-szabályrendszer a logP-n keresztül szabályozza, de ez az adat az oldhatóságra nem ad valós útmutatást. A fragmensek szűrésénél az oldhatóság kiemelten fontos szerepet tölt be, hiszen a szűrt molekulának általában nagy koncentrációjú oldatban kell lennie. A szűrés módszerétől függően a megkívánt oldhatóság változik, ezért ezt a paramétert az RO3-szabályrendszer keretén kívül kell kontrollálni. Használhatunk számított vagy mért oldhatósági értékeket, de míg az oldhatóság in silico becsülése nagy hibával terhelt, addig több ezer molekula oldhatósági görbéjének méréssel történő felvétele nagy erőforrásigénnyel jár (lásd 4.7.3. fejezet). Legvégül pedig még a fragmenskönyvtár megfelelő kémiai változatosságát (diverzitási fokát) is biztosítanunk kell. A diverzitás fontos szerepet tölt be a biológiai értelemben redundáns, valóban közeli analógok vizsgálatának elkerülése szempontjából, viszont nem megfelelő alkalmazása esetén olyan szűrésre alkalmas fragmenseket vehetünk ki a könyvtárból, amelyek hiányában új molekulacsaládok veszthetnek el, ezért ezt a kérdést érdemes részletesebben is megvizsgálni.

 

 

Az 4.3.5. ábrán látható két molekula Tanimoto-index alapján számított hasonlósága (0,52) kicsi, és a legtöbb diverzitásszűrő mindkét molekulát megtartaná. Mindkét molekula hasonló méretű és hasonló lipofilitású szubsztituenseket tartalmaz hasonló izomer konfigurációban. Ezért a két molekula várható biológia hatása a megfelelő kötőzsebben hasonló lehet annyira, hogy észleljük és megtartsuk a pozitív jelet. Ezzel viszont a másik molekula szűrése feleslegessé válik, mert a farmakofór és a kémiai család mindkét molekula esetében azonos. A diverzitásalapú szelekció tehát – ebben az esteben helytelenül – mindkét molekulát megtartja. A 4.3.6. ábrán látható eset azonban éppen ellenkező képet mutat. A három molekula teljesen azonos funkciós csoportokat tartalmaz, de különböző regioizomer helyzetekben. Rendkívül valószínűtlen, hogy egy fehérje zsebében a három karbonsavizomer mindegyike hasonló aktivitást mutasson, mert ha az egyik közel optimálisan kötődik, amint azt a magas LE-igény elvárja, akkor a többi valószínűsíthetően minimális vagy semmilyen aktivitással nem rendelkezik. Ebben az esetben tehát a három vegyület közül csak egynek a kiválasztása azzal a veszéllyel jár, hogy az adott kémiai csoport elvész olyan kötőzsebek esetében, amelyek a kihullott két molekula valamelyikével szívesebben lépnének szoros kölcsönhatásba.

 

 

A probléma további szemléltetésére (4.3.7. ábra) a Merck által II-es típusú cukorbetegség kezelésére kifejlesztett dipeptidil-peptidáz IV fehérje gátlásán keresztül ható szitagliptin (Januvia, lásd 4.9.3 fejezet) molekulafragmensekre való lebontását mutatjuk be (Makara, 2007).

 

 

A két bemutatott fragmens ujjlenyomataik alapján meglehetősen hasonlít egymáshoz, amit a karbonsav és a metilamid közötti 0,71 Tanimoto hasonlósági koefficiens is mutat. Maximális diverzitású fragmenskönyvtár létrehozásakor az algoritmus valószínűleg csak az egyik molekulát tartaná meg, de ha csak a karbonsav formát tartjuk meg a fragmenskönyvtárunkban, elképzelhető, hogy egyes fragmensszűrési technikák (például a biokémiai szűrés) a gyenge aktivitás és kötéserősség miatt nem találják meg ezt a fontos kémiai mintázatot. Ugyanakkor egy másik célpont esetében lehetséges, hogy a negatív töltésű karbonsav jelenléte a fontos, ezért a fragmenskönyvtárban valójában mindkét molekula megtartása teljességgel indokolt. A fragmenskönyvtárak diverzitása kapcsán összefoglalásként tehát megállapítható, hogy a kizárólag számítógéppel végzett hasonlósági elemzés segítségével folytatott tradicionális diverzitásalapú szűrés könnyen a biológiai aktivitás szempontjából fontos fragmensmolekulák elvesztéséhez vezethet, ezért a könyvtárak kémiai változatosságának biztosításához egyedi algoritmusokra vagy szakértő szem vizuális ellenőrzésére is szükség van.

 

 

A módszer lényegéből következik, hogy kiküszöböli az ujjlenyomatok legnagyobb hiányosságát: a fehérjékhez kötődés szempontjából fontos funkciós csoportok térbeli elhelyezkedésének lefedését, illetve a bioizoszterikus funkciós csoportok felismerését. További fejlesztési lehetőségként lehet említeni, hogy a kötőzsebek vagy a ligandumok alakjának analízise nem része a technológiának, ezért az alaki felismerés fontos szerepe jelenleg nem vehető figyelembe.