A fragmenskönyvtárak és HTS könyvtárak szűrése közti alapvető különbség a várható aktív molekulák affinitásbeli eltéréséből adódik. A jóval több potenciális kölcsönhatási ponttal rendelkező vezérmolekula-szerű anyagoknál („lead-like”) kisebb fragmensmolekuláktól a legtöbb esetben nem várhatunk el hasonló affinitást, ezért a hidrofil fragmenseket olyan tömény oldatban kell szűrni, ami a legtöbb esetben meghaladja a HTS alkalmazásokban szokásos biokémiai szűrés koncentrációtartományát, és így a nagyobb koncentrációra kevésbé érzékeny biofizikai módszereket igényel. A 4.3.2.1 fejezetben korábban bemutatott összefüggés következtében fragmensek millimoláris koncentrációtartományban való vizsgálatára a röntgendiffrakciós és NMR módszerek a legelterjedtebbek. Népszerűségük annak is köszönhető, hogy mindkét megközelítés atomi szintű információt szolgáltat a molekula és a célpont kölcsönhatásainak részleteiről, ami a fragmenstalálatok kiértékelésénél és rangsorolásánal, valamint az optimalizálás során értékes, sokak által elengedhetetlennek tartott segítséget nyújt. Az évek során az SPR-módszer is egyre népszerűbbé vált elsődleges és másodlagos szűrések esetében. A módszer jelentős hátránya, hogy nem ad semmilyen információt az aktív molekulák kölcsönhatásainak részleteiről, és bár nagy koncentrációtartományban is eredményes, a hamis pozitív találatok előfordulása gyakori. A hiányosságok kiküszöbölése végett az SPR segítségével azonosított aktív fragmenseket gyakran röntgendiffrakciós vagy NMR-megerősítésnek vetik alá. Ezért az SPR gyakorlatilag előszűrőnek is tekinthető, amivel a röntgendiffrakciós és NMR-vizsgálatok nagyobb időigényéből, magasabb költségéből és viszonylag korlátozott áteresztőképességéből fakadó hátrányokat lehet enyhíteni. A biofizikai szűrések egyik legnagyobb hátránya a vizsgálható fehérjecélpontok korlátozottsága: membránfehérjék, GPCR-fehérjék (G-protein kapcsolt receptorok) ezekkel a módszerekkel általában nem vizsgálhatók. A nagy méretű fehérjék az NMR-vizsgálatok szempontjából jelentenek gondot, és jelenlegi ismereteink nem teszik lehetővé az összes célpontként számításba jöhető fehérje kristályosítását sem. Ezekre a problémákra megoldást jelenthet a 2015 után rohamos fejlődésnek indult krio-elektronmikroszkópia (Cryo-EM), amivel nagy fehérjék, membránfehérjék és GPCR-fehérjék is egyre jobb felbontásban vizsgálhatók, igazi áttörést hozva a nehezen kezelhető makromolekulák atomi részletességű feltárásában. Összességében azonban továbbra is igaz, hogy egy korábban strukturális módszerrel nem vizsgált fehérje röntgendiffrakciós vagy NMR-módszerrel történő fragmensszűrése jelentős gyakorlatot, időt és befektetést igényelhet, míg krio-elektronmikroszkópiás szűrés napjainkban nem jellemző, de lehetséges (Saur és mtsai, 2020).

 

 

Amint az a 4.3.3. táblázatból látható, a biokémiai módszerekkel történő fragmensszűrés a biofizikai módszerekhez képest éppen fordított előnyökkel és hátrányokkal jár. Biokémiai szűrés általánosan alkalmazható minden olyan esetben, amikor a biokémiai tesztelésre kidolgozott módszer rendelkezésre áll, sőt kellő körültekintéssel akár sejtes szűrés is megvalósítható. Miután a biokémiai tesztek áteresztőképessége általában közepes vagy nagy, ezzel a módszerrel a fragmensuniverzumban nagynak számító több tízezres fragmenskönyvtárak szűrése is lehetséges. Fontos szempont továbbá, hogy a biokémiai vizsgálatok során közvetlen információt kapunk a fragmensek tényleges biológiai aktivitásáról, ami bizonyos esetekben jelentős mértékben segíti a fragmenstalálatok csoportosítását, rangsorolását (a ligandumhatékonyság-indexen keresztül) és hatásmechanizmusának azonosítását. A biológiai sajátságok ismerete, például agonista–antagonista molekulák megkülönböztetése, illetve aktivátorok és inhibitorok maximális aktivitásának becslése esetén válhat kritikussá. Mindezekért az előnyökért viszont nagy árat kell fizetnünk, mivel a biokémiai szűrések jellegükből adódóan nem szolgáltatnak szerkezeti információt sem a fragmenstalálatok megerősítéséhez, sem ezek optimalizálásához. Mindez azért bír különös jelentőséggel, mert a szerves kismolekulák nagy koncentrációban sok hamis pozitív jelet szolgáltathatnak, aminek egyik legmegbízhatóbb ellenszere lenne a fragmens és fehérje kapcsolatának vizuális megerősítése, ez pedig jelentősen felgyorsíthatná és megkönnyíthetné a fragmenstalálatok vezérmolekulává csiszolását.