A biológiai szűréseket leggyakrabban GPCR vagy membránfehérjék vizsgálatakor használják (Albert és mtsai, 2007). Ha a várható találati arány magas, akkor a szűréseket a 20–50 μM koncentrációtartományban valósítják meg. Fontos megjegyezni azonban, hogy az úgynevezett nehéz célpontok esetében a sikerhez a magasabb koncentrációtartomány használatára van szükség. Átlagos esetekben a tartomány középső része (200–250 μM) jó kiindulási pont lehet az előkísérletekhez, és ha a találati arány túl alacsony vagy éppen túl magas, akkor a szűrési koncentráció a végső szűrési kampányhoz a megfelelő irányba eltolható. A körülményeket befolyásolja a szűrésre tervezett könyvtár mérete is; minél több diverz fragmens áll rendelkezésünkre, annál jobb a mintavétel, és annál valószínűbb, hogy a találatok aktivitása jobb lesz, tehát a szűrési koncentrációt alacsonyabbra tervezhetjük. Ha a biológiai teszt reprodukálhatósága jó, akkor érdemes az aktivitási küszöbértéket és ezzel párhuzamosan a fragmensmolekulák koncentrációját csökkenteni a szűréshez. Mindezek azért fontosak, mert az elsődleges célunk az, hogy a szűrési koncentrációt a nagy koncentrációból adódó nehézségek csökkentése érdekében a minimálisan szükséges szintre állítsuk be, ami a találatok megerősítésekor válik hasznunkra.

A biokémiai szűrés kihívásai alapvetően a fragmens (vagy más szerves molekula) nagy koncentrációjából erednek, amihez a biológiai tesztek jellegzetességei is hozzájárulnak. A biológiai tesztrendszer a fehérjén kívül számos szerves és szervetlen kismolekulát tartalmazhat, amelyek összességükben kényes biológiai környezetet hoznak létre. A rendszer részeként a fehérje alacsony nanomoláris koncentrációban, míg a szubsztrát, a kofaktorok és a pufferként alkalmazott sók általában mikromoláris – esetleg alacsony millimoláris koncentrációban vannak jelen. Mivel a fragmensmolekulák a HCS során a biológiai rendszer összes komponensénél nagyobb vagy azzal közel azonos koncentrációban vannak jelen, ezért ha a rendszer részeivel kölcsönhatásba lépnek, vagy azokat bármilyen más módon befolyásolják, akkor hamis biológiai jelet adhatnak a valós mechanizmus befolyásolása nélkül. Ilyen mechanizmus lehet többek között például a fehérje vagy más komponensek oldatból való kiválása a tesztmolekula hatására, vagy az ionokkal való komplexképzés. Természetesen a tesztmolekula magában is képes problémákat okozni. Az elmúlt évtizedben egyre többet tudunk a szerves molekulák mikromoláris oldatokban való viselkedéséről. Ennek során nyilvánvalóvá vált, hogy sok szerves molekula mikromoláris koncentrációban szappanszerű micellákat formál. Ezek a micellák hajlamosak a fehérjéket kicsapni vagy velük nem-specifikus kölcsönhatásokba lépni, de akár azok kötőhelyeihez való hozzáférést aspecifikus módon gátolni (McGovern és mtsai, 2002). Szerencsére a problémák felismerésével lehetőség nyílt ezen hamis pozitív találatokat eredményező mechanizmusok kimutatására, és így a valódi találatok azonosítására. A hamis találatok kiküszöbölésére alkalmazott módszerek között megtalálhatjuk a titrálási görbék analízisét, oldhatósági méréseket a titrálási koncentrációs pontokban, a biológiai jel időfüggésének megállapítását, micellaképzők, illetve szérumalbumin (bovine serum albumin, BSA) hozzáadását a tesztrendszerhez, a biológiai jel fehérje-koncentrációfüggésének megállapítását, a részecskeméret mérését a fragmensmolekula oldatában, másodlagos biológia tesztek futtatását a célpont fehérjével, illetve más fehérjékkel, és másodlagos tesztek alkalmazását a fragmens kívánatos mechanizmusának megerősítésére (például a feltételezett kölcsönhatás energiatartalmának mérése izotermális titrálási kalorimetriával).

HTS-infrastruktúrával rendelkező kutatóhelyeknek vonzó opció lehet a már meglévő vegyülettár fragmenskritériumok alapján történő válogatása, és az így nyert fragmensek vizsgálata a rendelkezésre álló, korábban kidolgozott biológiai tesztben. A kritériumok esetleges lazításával akár nagyszámú szűrésre alkalmas molekula is kiválogatható. Fontos azonban a fragmensmódszerek kifejlesztéséhez vezető komplexitáselmélet megállapításainak figyelembevétele, ami szerint a komplexitással a találatok előfordulási valószínűsége fordítottan arányos. Tehát fontos, hogy a komplexitási kritériumokon ne lazítsunk, továbbá az is, hogy a fragmensek nagy koncentrációban történő mérésének lehetősége megmaradjon. Az oldhatósági követelmény például olyan paraméter, amit > 5–10 millimólosról a tervezett koncentráció szintjére csökkenthetünk. Egy jól megtervezett és kivitelezett biokémiai fragmensszűrés számos, már korábban részletezett előnnyel bír. Fontos szempont lehet az is, hogy a gyógyszerkémikusok az általuk HTS-szűrések során használt, megszokott biológiai adatokkal dolgozhatnak a rangsorolás és az optimalizálás során. A másodlagos biológiai tesztek futtatásakor segíthetnek a találatok kemotípusának az elsődleges teszt körülményei között már megismert tulajdonságai.