Az alkalmazott szűrési technológiától függetlenül a fragmens-kiindulópontok az esetek túlnyomó többségében gyenge aktivitást mutatnak, tehát azok szisztematikus optimalizálásába jelentős erőforrást kell befektetni. A kihívást annyira nagynak tartják, hogy az irodalmi konszenzus szerint a fragmens–fehérje kötődés szerkezeti részleteinek ismerete elengedhetetlenül szükséges a sikerhez. Pedig a feladat gyakorlatilag azonos a HTS-találatok optimalizálásával azzal az előnnyel, hogy a kiindulópont magas ligandumhatékonysága biztosítja a minőségi kölcsönhatásokat, amelyeket az optimalizálás során részben tovább kell javítani és ki kell terjeszteni. Az optimalizálási folyamatot elegánsan kerüli meg a már korábban leírt SHAPES módszer, ahol a fragmensek szerkezete csak a vezérmolekula-szerű („lead-like”) könyvtár fókuszálására szolgál, viszont ez azzal a hátránnyal járhat, hogy a ténylegesen új molekulák felfedezésének valószínűsége csökken. A SHAPES sikere azonban arra is utal, hogy a fragmens alapvető információját megőrző vezérmolekula-szerű vegyületekhez szisztematikus gondolkodással akár a fehérjeszerkezet ismerete nélkül is el lehet jutni. A másik általánosan elfogadott kritérium az optimalizálás előtt a fragmensek minőségét jellemzi: a ligandumhatékonyság (ligand efficiency, LE) 0,3-nál magasabb kell legyen. A LE igazából 0,4 felett lenne kívánatos, de kisebb fragmenskönyvtáraktól nem lehet elvárni, hogy minden kemotípusra ideális kiindulópontot szolgáltassanak. Fragmensek 0,3-nál kisebb LE értékkel csak akkor érdemelnek figyelmet, ha nincsen jobb találatunk vagy ha a célpont különös fontosságot élvez, esetleg ha a célponttal való kölcsönhatás atomi részleteiből nyilvánvaló beavatkozási pont azonosítható. Utóbbit, ha az optimalizálást szerkezeti információk nélkül kezdjük meg, 10–50 könnyen hozzáférhető vagy szintetizálható molekula tesztelése helyettesítheti.

 

A fragmensek optimalizálásának gyakorlata – elsősorban az aktivitásban meglévő 2–4 nagyságrendi különbségnek köszönhetően, – jelentősen eltér a HTS-sel azonosított kiindulópontok optimalizálási gyakorlatától. A fragmenstalálatok rangsorolása nem aktivitás, hanem valamilyen ligandumhatékonysággal összefüggő mutató alapján történik. Ez azért fontos, mert a fragmenstartományban egy 150 Da-os és egy 300 Da-os molekula között kétszeres méretbeli különbség van, míg az ekkora eltérések HTS-könyvtárak esetében ritkábbak. Ha pusztán az aktivitást használnánk, az félrevezető lenne, mert egy 300 Da tömegű fragmensnél egy másik 150 Da tömegű, de 20%-kal alacsonyabb aktivitású molekula rosszabbnak tűnne. Pedig a kisebb, de kevésbé aktív fragmens fajlagos aktivitása sokkal jobb, és ezért jobb kiindulópontnak (vezérfragmensnek) tekinthető, mint a nagyobb és aktívabb társa. Fontos szempont továbbá, hogy a fragmensek előnyős tulajdonságaiból az optimalizálás során a lehető legtöbbet megőrizzünk. A fragmenskritériumok gyakorlatilag garantálják azt, hogy a fizikokémiai paraméterek szempontjából a vezérfragmens kiváló tulajdonságokkal rendelkezzen, de ezt a kiváló kiindulópontot az optimalizálás során el is lehet rontani. Ezért a fragmens–vezérmolekula fázisban (is) kritikus, hogy a javuló affinitás ne csak nagy lipofil csoportok hozzáadásával, a molekulaméretet növelésével történjen, hanem a molekulák hatékony poláris kötéseket is létesítsenek a célponttal (Keserű és mtsa, 2009). A poláris csoportok jelenléte nagymértékben segíti a vezérmolekula fizikai kémiai tulajdonságainak elfogadható szinten tartását, és hozzájárul a kötődési szabadentalpia entalpiakomponenséhez. Az utóbbi években számos utalás jelent meg az entalpiakomponens szerepéről a nem specifikus aktivitások és terápiás mellékhatások csökkentésében és ezzel együtt az úgynevezett „best-in-class” gyógyszerek kifejlesztésében (Ladbury és mtsai, 2010).

 

A fragmensek szerkezeti információk által vezérelt optimalizálását a HSP90 (heat shock protein 90) fehérje gátlására talált kiindulópontból klinikai stádiumba jutatott példán mutatjuk be részletesen (Murray és mtsai, 2009, és Woodhead és mtsai, 2010).

 

 

Bár a kiindulási orto-metoxi-fragmens ligandumhatékonysági értéke 0,3 alatti (4.11, 4.3.12. ábra), a röntgendiffrakciós kép alapján nyilvánvaló volt, hogy ez jelentős mértékben a metoxicsoport elégtelen térkitöltésének a következménye: a 4.3.13. ábrán a 4.11 molekula felülete (kék színnel illusztrálva) nem nyúlik be a fehérje szürkére színezett zsebének jobb alsó, mélyen elhelyezkedő hidrofób részébe.

 

 

A metoxicsoport cseréje etil-, illetve terc-butil-csoportra 20-, illetve 100-szoros javulást eredményezett az izotermális titrálási kalorimetriával mért disszociációs állandóban, ami a ligandumhatékonyságot is a már elfogadható tartományba tolta (4.12, 4.3.12. ábra). Ezután az amidcsoport variálása került a reflektorfénybe. A karbonilcsoport oxigénatomja és gyűrűvel bezárt szöge fontosnak tűnt a háromdimenziós szerkezet alapján, ezért tercier amidokat szintetizáltak. A legjobb aktivitást az izoindolin-amid mutatta nanomoláris disszociációs állandóval és 0,4 feletti ligandumhatékonysággal (4.13). A ligandumhatékonyság folyamatos emelkedése is mutatta, hogy az optimalizálási folyamat valódi minőségi javulást is eredményezett a kemotipus kötődésében. A terc-butil-csoport izopropilra történő cserélését enyhe aktivitásjavulás kísérte. A fenol rezorcinolszerkezetté való átalakítását a radikikol hasonló kötődési módjának analógiájával magyarázhatjuk, mely végül is ugrásszerű javulást okozott az aktivitási és hatékonysági mutatókban (4.14). A 4.14 izoindolincsoportja a teret szűkítő 58-as lizin aminosav elmozdulásával megnyílt zsebrész kitöltésével további energianyereséget ért el, hozzájárulva a nanomolárisnál erősebb disszociációs állandó eléréséhez (4.3.14. ábra).

 

 

A 4.14 megfelelő aktivitással rendelkezett az in vitro biológiai tesztekben, de fizikokémiai és farmakokinetikai tulajdonságai még jelentős kívánalmakat hagytak maguk után. A bázikus piperazincsoport beillesztése a szervezetben való elosztást megváltoztatva, és ezáltal a rákos sejtekben nagy koncentrációt eredményezve segítette elő a hatékonyság javulását annak ellenére, hogy a kiürülés továbbra is a kívánatosnál magasabb maradt. Az optimalizált molekula 4.15 (Astex kód: AT13387) onaleszpib néven számos rákellenes kombinációs terápiára lett kipróbálva fázis I/II vizsgálatokban, de limitált klinikai hatékonyság miatt a gyógyszerjelölt további fejlesztése abbamaradt.