Az elmúlt években számos RNS-alapú gyógyszer került engedélyezésre vagy áll jelenleg is fejlesztés alatt, ideértve a vakcinákat és a nem vakcina típusú gyógyszereket is. Az Európai Unió (EU) jelenlegi jogszabályai szerint ezeket a készítményeket többféle szabályozási státuszba lehet sorolni: a vakcinák esetében a céljaik (fertőző betegség vagy nem), más gyógyszerek esetében pedig attól függően, hogyan állítják elő őket (kémiai vagy biológiai úton). Ez a besorolás alapvető fontosságú a piaci forgalmazási engedély (marketing approval; MA) típusát illetően, így az előírt vizsgálatokhoz is szükséges, egészen a preklinikai fázisoktól kezdve a klinikai vizsgálatokon át a gyógyszerbiztonsági vizsgálatokig. A 2.1.9. ábrán látható a gyógyszerek jelenleg elfogadott beosztása.

 

 

Az mRNS-alapú gyógyszerek innovatív, új terápiás lehetőséget nyújtanak, azonban az egyik fő kihívás a bioaktív hatóanyagok biztonságos, nagy hatékonyságú előállítása és az immunrendszert moduláló módszerek kifejlesztése. Az mRNS-vakcinák létrehozásához a fejlesztés során úgy módosították az mRNS szerkezetét, hogy növeljék annak stabilitását és elősegítsék az antigén-prezentáció szisztémás toleranciáját. Ugyanakkor a natív, kémiailag módosított mRNS-ek bejuttatása nem eléggé hatékony, és elégtelen mennyiségű antigénfehérje-termelődést eredményez. A nehézség megoldása érdekében lipid nanorészecskéket kezdtek alkalmazni a szállítás javítására és az mRNS extracelluláris lebomlással szembeni védelmére. Ez az előrelépés jelentős mérföldkő volt az mRNS-vakcinák fejlesztésében, és eloszlatta a szkepticizmust azzal kapcsolatban, hogy ez a technológia képes lesz klinikailag jóváhagyott gyógyszerek előállítására.

mRNS-terápiás készítmények

Az mRNS-terápiás készítmények lehetővé teszik egyes fehérjék szintézisét a kódoló szekvencia bejuttatásával, ami terápiás lehet olyan veleszületett enzim- vagy antitesthiány esetén, mint a III. típusú glikogénraktározási betegség (2.1.10. táblázat).

 

mRNS-alapú vakcinák

Az mRNS-alapú vakcinák a kórokozók vagy daganat antigének egyes szekvenciáit kódolják, így az immunrendszer modulálásával fejtik ki hatásukat. Ezen vakcinák közvetlenül adhatók a fertőző betegségek megelőzésére vagy kezelésére, illetve daganatok kezelésére. Ezek a vakcinák az EU álláspontja szerint nem azonos státuszba tartoznak, nem minősülnek GTMP-nek. A fertőző betegségek ellen vakcinák elsősorban megelőző jellegűek, míg a daganatok elleni „vakcinák” inkább gyógyító hatásúak.

 

mRNS-kódolt kimérikus antigénreceptor-alapú terápia (CAR-T)

A daganatkezelés immunterápiás megközelítése a daganatellenes T-sejtek tumorsejtek ellen történő aktiválására alapoz. A folyamat során stabil integrációval egy kimérikus antigénreceptort (chimeric antigen receptor; CAR) építenek be a T-sejtekre, amely a daganat antigénjeit MHC-függetlenül ismeri fel. A jelenlegi CAR-T sejteket, amelyeket ex vivo módosítanak DNS hozzáadásával, GTMP-ként sorolták be.

 

Az mRNS-alapú terápiát várhatóan számos, a jelenleg elérhető kezelésekkel szemben rezisztens betegségben fogják alkalmazni, ilyenek például a fertőző betegségek, a metabolikus genetikai betegségek, a daganatos betegségek, a szív- és érrendszeri betegségek, az agyi érrendszeri betegségek. Az mRNS-alapú gyógyszerek további előnye lehet a nagy hatékonyság, a kevés mellékhatás és a relatíve könnyű előállítás. A Covid–19 terjedésének megállítása érdekében alkalmazott mRNS-vakcinák már bizonyították, hogy biztonságos és hatékony stratégiát jelentenek a fertőző betegségek megelőzésében. Az első, sürgősséggel engedélyezett mRNS-vakcinát a BNT/Pfizer készítette (BNT162b2), és engedélyezését gyorsan követte a Moderna vakcinaengedélye (mRNA-1273). Ezek a vakcinák mindegyike ~ 90%-os hatékonyságú volt a vad típusú SARS-CoV-2 fertőzés megelőzése szempontjából a teljesen beoltott egyéneknél, és ~ 80%-os hatékonyságú a részben beoltott felnőtteknél. Számos stratégiát azonosítottak a Covid–19 mRNS-vakcinák hatékonyságának további javítására, ilyen például két prolinkodon mutációja az S fehérje transzlációs termékének stabilizálása érdekében vagy a prefúziós S fehérjét kódoló módosított mRNS használata (BNT162b2 és mRNS-1273).

 

 

Az oligonukleotidok (ON) és az oligonukleotid-terápia (OT) potenciálisan sokféle betegség kezelésére alkalmazhatók. Az oligonukleotidok kis, egyszálú vagy kétszálú DNS- vagy RNS-szegmensek, amelyek 10–50 nukleotidból állnak, és gyakran undruggable (vagyis farmakológiailag nem célozható) fehérjékhez köthetőek. Az OT-k változatos módon léphetnek működésbe: megakadályoznak, helyettesítenek, hozzáadnak vagy szerkesztenek RNS-t és DNS-t molekuláris szinten. A hagyományos kismolekulákhoz képest, amelyek jelentősebb optimalizálást igényelnek, az ON-modulációk a primer szekvencia ismeretére alapozva tervezhetők. A kismolekuláknál a kihívást az ún. off-target toxicitás (vagyis a célmolekulától eltérő molekula befolyásolásával létrejövő mellékhatás) és a nem célozható fehérjék jelentik, míg az ON lehetővé teszi a precíz és testreszabott kezelést minimális off-target hatásokkal. Korábban a legtöbb OT esetében hátrányként volt elkönyvelve az alacsony orális biológiai hozzáférhetőség. Azonban a jelenlegi kutatások felszívódást fokozó szerek (például nátrium-kaprilát) egyidejű használata mellett már sokkal jobb biohasznosulást mutattak. Az oligonukleotidokat exo- és endonukleázok metabolizálják, szemben a kismolekulák által használt P450 enzimrendszerekkel. A metabolizmust a máj vagy a vese általi kiválasztás követi. Az OT használatának egy másik előnye a mellékhatások alacsony száma. Az OT-k a replikáló DNS-t vagy RNS-t célozzák, ezáltal rendkívül szelektívek a megcélzott szekvenciájuk iránt, ellentétben a kismolekulákkal, melyek számos off-target hatást mutatnak. A terápiás nukleinsavak a Watson–Crick bázispárosító modelleknek megfelelően kapcsolódnak a komplementer nukleinsavakhoz, így lehetővé teszik a genetikai célpontokkal szembeni gyógyszerek gyors és céltudatos fejlesztését. Az FDA által jóváhagyott oligonukleotid-terápiás készítményeket a 2.1.11. táblázat mutatja.

 

 

Az oligonukleotid-alapú terápiák többféle mechanizmuson keresztül hatnak, a szerkezettől és a kémiai felépítéstől függően. A terápiás nukleinsavak komplementer nukleinsavakkal kapcsolódnak a Watson–Crick-bázispárosítás révén.

 

Antiszensz oligonukleotidok (ASO)

Az ASO-k olyan kis, egyszálú (8–50 bázis) oligodezoxiribonukleotidok, melyek képesek az RNS módosítására és adott fehérje expressziójának következményes gátlására. 1998-ban az USA gyógyszerhatósága (Food and Drug Administration, FDA) engedélyezte az első antiszensz oligonukleotidot, a fomivirszent. Az ASO-k számos mechanizmus révén működnek, amelyek a következő csoportba sorolhatók: a) összeillesztés- (ún. splice) modulátorok b) sztérikus blokkoló oligonukleotidok, valamint c) génexpresszió-gátlók (RNáz H-indukálta lebontás).

 

RNS-interferencia

Az RNS-interferencia (RNAi) újonnan megismert, gyors géncsendesítő módszer. A rövid RNS-fragmensek lecsendesítik, vagyis gátolják a gén expresszióját azzal, hogy gátolják vagy lebontják a fehérjekódoló mRNS-t, így megakadályozva a fehérje szintézisét. Az RNAi-készítmények közé kétféle kisméretű RNS-molekulát sorolunk, a kis interferáló RNS-t (siRNA) és a mikro RNS-t (miRNA).

 

Kis interferáló RNS (siRNA)

A siRNA-k rövid, nem kódoló dupla szálú RNS-ek, amelyek egyedileg szabályozzák a génexpressziót, kifejezetten az mRNS-célpontokon hatva. A siRNA-interferencia hatásmechanizmusa a gének poszttranszkripciós szinten történő elnémításán alapul, gátolva a génexpressziót az mRNS lebontásával. Egy siRNA 19–21 nukleotidból áll, amelyben a TT és UU nukleotidok nagymértékben túlnyúlnak a 3’ végén. A kétszálú RNS (dsRNA) hatékonysága a hosszával arányosan növekszik. Az ún. Dicer-enzim a hosszú endogén dsRNS-t siRNA-vá alakítja, amely blokkolja a célgén kifejeződését. A hasított (ún. cleaved) dsRNS két egyszálú RNS-e kölcsönhatásba lép az endonukleáz Argonauta 2 (AGO2) enzimmel, így létrehozzák a siRNA-indukálta csendesítő komplexet (siRISC). Miután az érzékeny szál kiszabadul, az antiszensz szál a RISC-komplexben marad. Ezután az aktivált RISC-komplex a célnukleinsavhoz kapcsolódik komplementer párosítással, ezáltal a célnukleinsav lebontásához vezet.

Mikro-RNS (miRNA)

A miRNA-k 21–25 nukleotid hosszú, egyszálú RNS-fragmensek, amelyek kulcsszerepet játszanak a génexpresszió szabályozásában. Ezek kis, nem kódoló RNS-molekulák, melyek miRNA- előalakból szintetizálódnak két RNáz-II/III segítségével. Hatásukat a cél mRNS-en különböző módon érhetik el. Lebontják az mRNS-t különböző célpontokon hatva, és egy adott területen a célnukleinsav 3’ UTR-régójában kapcsolódva gátolják a transzlációt, deadenilációt és a levágást. Ezeket a kötődési helyeket az 5’ UTR mRNS-régió azonosítja, ezáltal a kódoló régiók és a génexpresszió lecsendesítéséhez vezet. Ez a miRNA által indukált csendesítő komplex (miRISC) tartalmazza az irányító szálat és az AGO-t. A miRISC komplementer párosítást végez a célnukleinsavval, a megfelelő szekvenciákat miRNA-válaszelemeknek (miRNA response element, MRE) nevezik. Ezzel a mechanizmussal egy miRNA számos mRNS-t bonthat le több célponton hatva, így ezek vonzó gyógyszercélpontokká váltak multifaktoriális betegségek, például daganatos és neurodegeneratív betegségek esetén. Ezen túlmenően klinikai biomarkerként segíthetik a betegségek diagnosztikáját és a betegségek progressziójának nyomon követését. Fontos hangsúlyozni, hogy a miRNA-típusú gyógyszerek jelenleg még fejlesztés alatt állnak. Példaként említendő a daganatos betegségek kezelésére szánt MRX34. Ez az egyik első jelölt, amely klinikai vizsgálatba került miRNA-helyettesítő terápiaként, liposzómaformulációkkal a miRNA-34 hatás utánzására. Ez egy természetes előfordulású daganatellenes gént modulál, amely gátolja a rosszindulatú májdaganat növekedéséhez szükséges jellegzetes jelátviteli útvonalakat. Egy másik jelölt a TargomiRS, amely utánozza a miRNA-16 hatásait. Ez a készítmény a daganatnövekedést és -terjedést elősegítő gén transzkripcióját gátolja. A miRNA-k elsődleges hátrányai közé tartozik a központi idegrendszerbebe való eljuttatás nehézsége és a stabilitás, amely hasonló a siRNA-éhoz; mindkettő inherens negatív töltésű, hidrofil természetű és nagy molekulatömegű. Az RNSi-terápiák – a siRNA és a miRNA – a közeljövőben fontos szerepet játszanak a génexpresszió gátlásában.

 

Aptamerek

Az „aptamerek” kifejezés a rövid, szintetikus RNS- vagy DNS-oligonukleotidok vagy -peptidek osztályát írja le. Ezek a célponthoz szelektíven nagy specificitással és affinitással kötődnek, gyakran a fehérjék közötti kölcsönhatásokat is gátolják. Az aptamerek aktivitása azon a képességükön alapul, hogy háromdimenziós struktúrákat képesek létrehozni a célponthoz kötődés során. Az aptamerszekvencia mérete általában 15 és 60 nukleotid között változik, de a legjobban működő aptamerek mérete 40 nukleotid körül mozog. A nem módosított aptamerek felezési ideje 2 perc, mivel nukleázok hatására gyorsan degradálódnak. Ezek különböző célpontokon hatnak; a fehérjéket, peptideket, fémionokat, metabolitokat, toxinokat, szénhidrátokat, baktériumokat, vírusokat, élő emlős sejteket és kis szerves molekulákat célozzák meg.

Klaszterezett, rendszeresen elhelyezkedő palindromikus ismétlések

A CRISPR olyan DNS-szekvenciák csoportja, amely a prokariótákban található, és azok adaptív immunrendszerét alkotja a fertőző bakteriofágokkal szemben. A CRISPR-hez társított 9-es fehérje (CAS9) restrikciós endonukleáz, amely a CRISPR-szálakat hibridként használja arra, hogy azonosítsa és hasítsa a CRISPR-szekvenciákkal komplementer DNS-szálakat, ezzel közvetítve a genom módosítását. A CRISPR-CAS9 génszerkesztési technológia lehetővé teszi a genom korrekcióját, valamint a gének viszonylag hatékony és specifikus knock-down vagy knock-in változtatását. Ennek a restrikciós rendszernek a terápiás alkalmazásait különböző betegségek esetében már széles körben tanulmányozzák (https://innovativegenomics.org/news/crispr-clinical-trials-2024), ilyenek például az Alzheimer-kór, a HIV, a sarlósejtes anémia, a daganatos megbetegedések; jelenleg a CRISPR-CAS-alapú kezelések a kezdeti klinikai vizsgálatok fázisában vannak.

 

Az OT jelentős fejlődésen ment keresztül az alapvetően széles betegségspektrum kezelésében rejlő potenciálja következtében (2.1.10. ábra). Az OT-gyógyszerek a gyors elterjedést és népszerűséget az alábbi előnyöknek köszönhetik:

1) Az oligonukleotid-gyógyszerek modulálhatják a különböző betegségek kulcsfehérjéit, így a humán genomban több mint 10 000 fehérjét, amelyekről korábban úgy vélték, nem támadhatók kismolekulákkal vagy fehérjeterápiákkal.

2) A gyógyszerjelöltek tervezése csupán a betegség patogenezisében részt vevő mRNS célpontszekvenciájának azonosítását igényli.

3) A komplementer oligonukleotid-szekvenciák új könyvtárait viszonylag könnyen és gyorsan szintetizálhatják. Az aktív farmakoforok akár hetek alatt azonosíthatók, és a megfelelő gyógyszer gyorsan előállítható.

4) Az oligonukleotid-gyógyszereket széles körben alkalmazzák neurodegeneratív betegségek (pl. amiotrófiás laterális szklerózis, Huntington-kór, gerincvelői izomsorvadás), légzőszervi rendellenességek (pl. asztma és COPD), diabéteszes retinopátia, valamint számos daganattípus kezelésére. A nukleotid gerincének vagy az oligonukleotid cukorrészeinek specifikus strukturális módosításai javítják a gyógyszer biztonságosságát és kinetikai tulajdonságait.

5) A kis molekulákhoz viszonyítva az OT tervezésének, formulálásának, gyártásának és ipari méretű tisztításának költséghatékonysága jobb.

6) Számos egyszerű és megbízható gyártási platform áll rendelkezésre, a tételes plazmid DNS bioprocesszálástól és a sejt nélküli enzimatikus szintézistől kezdve a teljesen kémiai szintézisig.

7) Az oligonukleotid-gyógyszereknek jobb a biztonsági profilja és megengedőbbek a fejlesztés szabályozási követelményei.

 

A legfőbb problémák közé tartozik a potenciális toxicitás, a gyógyszermolekulák szállítása és felvétele. Például a foszforotioát-módosított oligonukleotiddal (PS-ODN) történő kezelés csökkentette a vérlemezkék számát, ún. trombocitopéniát okozva. A toxikológiai problémákat okozhatják a szekvenciák és a kémiai módosítás, vagy az oligonukleotidok kötődése a sejtfelületen vagy szérumban lévő fehérjékhez. A PS-ODN aktiválhatja a komplementrendszert, ezzel szívritmus- vagy vérnyomásváltozást idézhet elő. Különböző preklinikai vizsgálatokban az immunstimuláló hatásokat több siRNA- és antiszensz oligonukleotiddal is összefüggésbe hozták. Szintén probléma a nukleázok általi lebontás, különösen a ribóz vagy dezoxiribóz cukrokból álló természetes oligonukleotidok esetében, amelyek foszfátgerincet és bázisokat tartalmaznak. További probléma lehet például a nukleotid-5’-monofoszfátok esetében, hogy a lebontási termékek gátolhatják a sejtek növekedését és proliferációját.

 

Az epigenom módosítása régóta potenciális terápiás lehetőségnek számít, már többféle terápia is forgalomban van elsősorban a daganatok kezelésére. Az első terápiás készítmények ígéretessége ellenére azonban ezeket a gyógyszereket gyenge farmakokinetikai és biztonságossági, valamint tolerálhatósági profil jellemezte, nagyrészt az off-target hatások és a specificitás hiánya miatt.

DNS-metiltranszferáz- (DNMT) gátlók

A DNS-metiltranszferázok olyan citozin-metilázok, amelyek kulcsszerepet játszanak az epigenetikai szabályozásban azáltal, hogy jeleket helyeznek el magán a DNS-en. A DNS-metiláció fontos szerepet játszik a daganatkialakulásban, mivel epigenetikailag szabályozza a daganatok fiziológiájával kapcsolatos gének expresszióját (vagy annak hiányát). Ezeket a vegyületeket az USA-ban krónikus mielomonocitás leukémia (CMML) és akut mieloid leukémia (AML) kezelésére is jóváhagyták a közelmúltban. 2022-ben újabb indikációként juvenilis mielomonocitás leukémiára is alkalmazni kezdték. A jelenlegi alkalmazás ellenére e kezelések biztonságossági profilja előnytelen, és ez korlátozza klinikai alkalmazhatóságukat.

 

Hiszton-deacetiláz- (HDAC) gátlók

A hiszton-deacetilázok olyan enzimek, melyek a hisztonok lizin oldalláncairól eltávolítják az acetilcsoportokat, lehetővé téve a kromatin szorosabb feltekeredését, így csökkentve a transzkripció hozzáférhetőségét. Az első jóváhagyott epigenetikai gyógyszer a vorinostat és a romidepszin volt. Ezeket a szereket fenotípusos megfigyelések alapján fedezték fel anélkül, hogy előzetesen ismerték volna HDAC-gátló hatásmechanizmusukat. A Merck által kifejlesztett vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA) egy pán-HDAC-gátló, amely hatékonynak bizonyult több daganattípus korai vizsgálataiban. Végül 2006-ban kapott jóváhagyást az FDA-tól kután T-sejtes limfóma (CTCL) kezelésére. A romidepszint nagy áteresztőképességű szűrővizsgálatokkal azonosították. 2009-ben kapta meg a jóváhagyást CTCL kezelésére. A vorinostattal ellentétben a romidepszin szelektivitást mutat az I. osztályú HDAC-ok irányában.

 

Az új DNMT-gátlók közül több vegyületet fejlesztettek ki, kihasználva az új kísérleti lehetőségeket. Ezek a szerek a promóter demetilációján keresztül képesek reaktiválni géneket a daganatsejtekben. Eddig több ilyen vegyületet teszteltek különböző daganattípusban, például a guadecitabint (SGI-110) és a fluorociklopentenilcitozint (RX-3117), de egyik sem kapott engedélyt a klinikai használatra a korlátozott hatékonyság miatt.

 

Az epigenetika jobb megértésével és a terápiás ablak, valamint a biztonságossági profil javításának igényével a kutatások új célpontokra irányultak: lizin-, hiszton-metiltranszferázokra (KMT), lizin- demetilázokra (KDM) és bromodoméngátlókra. Az említett az epigenetikai effektorokat célzó szerek gyorsan eljutottak a klinikai vizsgálatokig, és a közeljövőben várható az esetleges jóváhagyásuk. Ellentétben a korábbi generációkkal, ahol a felfedezés véletlenszerű volt és az epigenetikai hatás ismeretlen, ezeket az újabb vegyületeket már a hatásmechanizmusuk előzetes ismeretében azonosították.

 

Hiszton-metiltranszferáz-gátlók

A hiszton-metiltranszferázok, akár KMT-k, akár protein-arginin-metiltranszferázok (PRMT), poszttranszlációsan egy és három közötti metilcsoportot adnak a hisztonfehérjék lizin- vagy argininoldalláncaihoz, aminek számos fontos következménye van. A metilált lizinoldallánc specifikus pozíciójától függően gátolhatja vagy aktiválhatja a génátírást. Az Epizyme által kifejlesztett pinometostat (EPZ-5676) volt az első KMT-gátló, amelyet leukémia kezelésére használtak Hatékonysága a korábbi generációs epigenetikai terápiákhoz hasonlóan mérsékelt volt, bár a tolerálhatósága némileg javult; ennél a szernél azonban megnövekedett fertőzésveszélyt figyeltek meg. Az EZH2 KMT enzim célzása tazemetostattal végül sikerhez vezetett az Epizyme számára; a készítmény epiteloid szarkóma és follikuláris limfóma kezelésére engedélyt kapott 2020-ban. Más hematológiai malignitásokban is vizsgálják az alkalmazhatóságot, köztük diffúz nagy B-sejtes limfómában.

 

Lizin-demetiláz-gátlók

A lizin-demetilázok visszafordítják a lizinmetilációt a DNS-en vagy a hisztonfehérjéken (és akár más molekulákon), ezzel megváltoztathatva a gének átírását a promóternél vagy a kromatinállapot változásain keresztül. A KDM-típus egyik családja, a lizinspecifikus demetilázok (LSD) mechanizmusukban homológok a monoamin-oxidázokkal; így a MAO-gátlókat epigenetikai terápiás eszközökként újrapozicionálták. A tranilcipromin MAO-gátló, amelyet eredetileg 1961-ben hagytak jóvá antidepresszánsként, de a jelenlegi klinikai vizsgálatokban, potenciális terápiaként, vizsgálják az AML és a mielodiszpláziás szindróma kezelésére.

 

Bár a monoterápiás megközelítések nem hoztak olyan komoly eredményeket, mint amit a terület várt, ígéretesek lehetnek a kombinációs alkalmazásban szolid tumorok esetén. A tumorok gyakran halmoznak fel többszörös defektusokat (mind mutációkat, mind epigenetikai diszregulációkat) a daganatok növekedése és áttétképzése során, ezért az egynél több cél egyidejű támadására több terápiás megközelítés kombinációja kiváló alternatíva lehet.