Mandl József (szerk.)

Biokémia

Aminosavak, peptidek, szénhidrátok, lipidek, nukleotidok, nukleinsavak, vitaminok és koenzimek

4.3.1. DNS denaturálás és renaturálás

A DNS működése során gyakran jön létre szerkezetváltozás, így a DNS-replikáció során a DNS-szálak kitekerednek, és a másolás az egyszálú DNS-ről történik, anélkül, hogy kovalens kötések szakadnának meg. Hasonlóan tekeredik ki a DNS oldatban is, melegítés, magas pH vagy magas sókoneentráció hatására, amikor a hőenergia, vagy a jelen levő ionok a hidrogénkötéseket és az egyéb gyenge kölcsönhatásokat megszüntetik. A két lánc teljes széttekerését a DNS denaturálásának, olvadásának nevezzük. DNS-denaturálás egy szűk hőmérsékleti tartományban következik be, amit számos fizikai paraméter változása kísér. A legegyszerűbben mérhető a DNS-oldat fényelnyelés-változása 260 nm-nél. A dsDNS fényelnyelése, ami a heterociklusos gyűrűktől származik, kb. 40%-kal alacsonyabb, mint a szabad nukleotidok fényelnyelése. A jelenséget hypochrom effektusnak nevezzük, és a nukleotid bázis párok hidrofób kölcsönhatásából származik, ami a helikális szerkezetben jön létre. A hélix összeomlása a fényelnyelés növekedésével jár, amit hiperchrom effektusnak nevezünk. A szűk hőmérsékleti tartománynak a középpontját (inflexiós pont), amelyen a DNS két szála széttekeredik, olvadáspontnak (Tm pont) nevezzük. A DNS-olvadáspont meghatározását mutatja a 4.26. ábra és 4.27. ábra.

A Tm pont mérése többféle módszerrel is történhet. A Tm értéke több dologtól is függ, ezek közül első helyen a DNS GC bázispár tartalma áll, mivel ezt a két bázist három hidrogénkötés tartja össze, szemben az AT bázispárok két hidrogénkötésével, előbbi magasabb, utóbbi alacsonyabb Tm értéket eredményez. A DNS „olvadása” ín vivo körülmények között is bekövetkezik, először az AT-gazdag szakaszokon, amit specifikus fehérjék segítenek. A dupla helix stabilitását befolyásolja a környezet, igy a sókoncentráció és a pH is. A különféle eredetű DNS-ek olvadáspontja a 85–95°C között van, ha fiziológiás ionkoncentrációt biztosítunk.

Harvard

(): . : . : /hivatkozas/m1344bikaps_1003/#m1344bikaps_1003 ()

Chicago

. . . : . (: /hivatkozas/m1344bikaps_1003/#m1344bikaps_1003)

APA

(). . . (: /hivatkozas/m1344bikaps_1003/#m1344bikaps_1003)

BibTeX EndNote Mendeley Zotero

4.26. ábra. A DNS denaturálása és a fényelnyelés növekedése

Harvard

(): . : . : /hivatkozas/m1344bikaps_1005/#m1344bikaps_1005 ()

Chicago

. . . : . (: /hivatkozas/m1344bikaps_1005/#m1344bikaps_1005)

APA

(). . . (: /hivatkozas/m1344bikaps_1005/#m1344bikaps_1005)

BibTeX EndNote Mendeley Zotero

4.27. ábra. DNS-denaturálás és -renaturálás

A ssDNS (single strand vagy egyszálú DNS), amelyik a denaturáció során keletkezik, stabil, azonban bizonyos körülmények között a két komplementer szál újra összekapcsolódik, renaturálódik (4.27. ábra). Ez a tulajdonság az alapja egy nagyon fontos kísérleti technikának, a nukleinsav hibridizálásnak.

A lineáris dsDNS-molekulák, melyekről eddig beszéltünk, két szabad véggel rendelkeznek, ezek könnyen széttekerhetők, denaturálhatok. Mikroorganizmusokban, vírusokban, sőt emlőssejtekben azonban zárt, kör alakú DNS-molekulák vannak. Ilyen DNS-t tartalmaznak a mitochondriumok. A fiók DNS-ek vagy a plazmidok. melyek szintén dupla szálú, kör alakú DNS-molekulák, extranukleárisan helyezkednek el a sejtekben. Magasabb hőmérsékleten a két lánc között a H-kötések ebben a formában is elszakadnak, a két, kör alakú DNS-szál azonban nem tud teljesen kitekeredni, összekapcsolt egyszálú DNS-gyűrűk halmazát kapjuk a denaturáció után (katenált DNS), Abban az esetben, ha a natív, cirkuláris DNS-t behasítjuk mindkét láncon vagy csak az egyiken, a denaturáció során a két lánc teljesen széttekeredik. Ilyen hasítást készítenek a sejtben dezoxiribonukleáz enzimek (DNáz), amelyek egyetlen foszfodiészter kötést hasítanak el, gyűrű esetén újra zárják a molekulát.