Mandl József (szerk.)

Biokémia

Aminosavak, peptidek, szénhidrátok, lipidek, nukleotidok, nukleinsavak, vitaminok és koenzimek

4.3.2. A DNS-hibridizálás alapja a bázispárképzés

A DNS-denaturáció reverzibilis folyamat, renaturációnak nevezzük, amikor komplementer nukleinsavszálak (ssDNS) újra dupla hélixszé alakulnak (4.27. ábra). A renaturáció alapja, hogy a komplementer szálak között újra kialakuljanak a specifikus bázispárok, Ha a renaturáció különböző eredetű nukleinsavszálak vagy DNS és RNS között jön létre, hibridizációról beszélünk, A hibridizáció a szekvenciakomp-lementaritásnak nagyon pontos mérő módszere. A reakció lényege, hogy két egyszálú nukleinsav-preparátumot keverünk össze, és mérjük a keletkezett dupla szálú anyag mennyiséget.

A technikának rendkívül nagy a jelentősége az elméleti és alkalmazott orvostudományok és a molekuláris biológia területén. Ismert DNS- vagy RNS-minták (gének) segítségével kereshetjük meg a velük analóg komplementer szekvenciákat pl. a humán sejtekből izolált DNS-ben. A veleszületett, öröklődő betegségek születés előtti (prenatális) felismerésének, a genetikai kapcsolatok meghatározásának ma az egyetlen biztonságos módszere a nukleinsav-hibridizálás.

A DNS-hibridizálás kivitelezésére két lehetőség van:

oldatban való hibridizálás
szilárd hordozón, ún. filteren történő hibridizálás.

Az oldathibridizálás, mint az a nevéből is következik, úgy történik, hogy a két ssDNS-preparátumot oldatban keverjük össze. Kellő mennyiségű anyag esetében a hibridizálási reakciót a 260 nm fényelnyelés változásával is követhetjük. Ha kis mennyiségű anyagunk van (ez áll fenn gyakrabban), akkor a reakció követésének egyik lehetősége, hogy az egyik DNS-preparátum radioaktívan jelzett legyen. Ebben az esetben a dupla szálú DNS (dsDNS) mérésével határozhatjuk meg a hibridizáció mértékét. A dsDNS mennyiségének mérése vagy kromatográfiás elválasztás útján történhet, vagy úgy, hogy az ssDNS-t, amelyik nem hibridizált duplaszálú DNS-sé, enzimatikusan lebontjuk, és csak a jelzett dsDNS-t mérjük. Az oldatban történő hibridizálás számos nehézséget is hordoz. Ebben az esetben a vizsgálandó dsDNS-t előbb denaturálni, azaz ssDNS-sé kell alakítani a hibridizálás előtt, ezután adjuk hozzá a vizsgálandó, jelzett ssDNS-t. Egy időben két reakció is lejátszódik. Az egyik reakció, hogy az eredeti komplementer, ssDNS-szálak renaturálódnak, a másik, hogy ezzel párhuzamosan történik a minta ssDNS hibridizációja is. A két reakció versengése miatt a hibridizáció mértékének mérése nehézkes.
A fenti nehézség kiküszöbölésére dolgozták ki a szilárd hordozón, szűrőn (filter) történő hibridizálást, amelyben az egyik DNS-preparátumot fixálják, hogy elkerüljék az oldatban bekövetkező renaturációt. A DNS fixálására a leggyakrabban a nitrocellulózszűrőt használják, amely nagyon jól köti a ssDNS-t, és nem köti a ssRNS-t. Ha a filterre egyszer ssDNS-t adszorbeálnak, különböző kezelések megakadályozzák a további egyszálú nukleinsavak kötődését. A 4.28. ábra mutatja a DNS filter-hibridizálási módszert, amelyben a DNS-preparátumot először denaturálják, majd az ssDNS-t a filterhez kötik. Ezután adják hozzá a második denaturált DNS- (vagy RNS-) mintát, amelyik csak akkor kötődik a filterhez, ha komplementer az eredeti DNS-sel. Ha a másodszor adott DNS- vagy RNS-minta radioaktívan jelzett volt, a hibridizálás mértéke arányos a filterre kötött radioaktivitással. Ezt a módszert használják ma a leggyakrabban a biológiai és orvosi diagnosztikában.