Falus András, Buzás Edit, Holub Marianna Csilla, Rajnavölgyi Éva (szerk.)

Az immunológia alapjai


14.21. Polimeráz láncreakció (PCR)

A polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction – PCR) rövid DNS-szakaszok sokszorozására szolgáló molekulárbiológiai technika. A vizsgálandó DNS mennyiségének növelése lehetővé teszi az adott DNS-szakasz különböző módszerekkel való további tanulmányozását, feldolgozását. A PCR reakció alapvető kellékei a következők:
  • DNS-templát: az a DNS-szakasz, amely tartalmazza a sokszorosítani kívánt szekvenciát.
  • Primerek: 18-25 nukleotidból álló DNS-szakaszok, amelyek szekvenciája komplementer a sokszorosítandó DNS-szakasz elejének és végének szekvenciájával.
  • Taq-polimeráz: hőstabil DNS-polimeráz, amely a DNS-szintézist végzi.
  • Nukleotidok (dNTP): a DNS építőkövei.
  • Puffer: a DNS-szintézishez optimális ionösszetételű puffer.
 
Maga a reakció ún. thermal cycler-ben megy végbe, amely az egyes lépésekhez szükséges hőmérsékletet biztosítja. Egy tipikus PCR reakció 20-35 ciklusból áll. Minden ciklus az alábbi lépésekből tevődik össze:
  1. Denaturálás: a kettősszálú DNS inkubálása 94–96 oC-on, amely a szálak szétválásához vezet.
  2. Annealing: 45–60 oC-on végbemenő lépés, amelynek során a primerek a nekik megfelelő komplementerszekvenciákhoz kötődnek.
  3. Extension: a DNS-szintézis szakasza. Az előző lépésnél kb. 5 oC-kal magasabb hőmérsékleten megy végbe. A Taq-polimeráz a primerektől kiindulva megszintetizálja a komplementer DNS-szálat.
 
A ciklusok során a sokszorosítandó DNS mennyisége exponenciálisan nő. A PCR nagyon érzékeny metodika. A legkisebb DNS-szennyeződés is fals eredményekhez vezethet. Az előkészítést lamináris fülkében, steril körülmények között tanácsos végezni, csakis erre a célra használt pipettákkal és eszközökkel.
Az RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) mRNS detektálására (génexpresszió vizsgálatára) szolgáló PCR-módszer. Az első lépésben reverz transzkriptáz (RNS-dependens DNS-polimeráz) az mRNS-ről dNTP-k felhasználásával komplementer DNS (cDNS)-t szintetizál. Ezután egy standard PCR reakció következik a cDNS megfelelő szakaszának sokszorozása céljából.
Az RT-PCR kvantitatív formája a real-time RT-PCR vagy qRT-PCR. A módszer lényege, hogy minden ciklus után detektálják a képződött DNS mennyiségét. A mennyiségi meghatározás történhet a DNS-be interkalálódó fluoreszcens festékkel, vagy olyan, fluorokrómmal konjugált oligonukleotidokkal (próbákkal), amelyek csak a PCR-termékbe beépülve adnak jelet. Kezdetben az újonnan szintetizálódó DNS mennyisége lassan nő, majd a folyamat egy exponenciális növekedés stádiumába lép, végül, a reagensek elhasználódása miatt elér egy tetőfokot, platót. Az, hogy az exponenciális fázis mikor következik be, a kiindulási cDNS mennyiségtől függ. A qRT-PCR technikák különböző minták mRNS tartalmát hasonlítják össze azon az alapon, hogy mikor következik be a DNS-szintézis exponenciális fázisa. Az expressziót általában egy kontrollként használt, ún. housekeeping gén expressziójára normalizálják.
 

Az immunológia alapjai

Tartalomjegyzék


Kiadó: Semmelweis Kiadó

Online megjelenés éve: 2026

ISBN: 978 963 331 710 5

Hét év telt el a „Az Immunológiai alapjai” című tankönyv kiadása óta. A természettudományok számára hét év nagyon hosszú idő, különösképpen így van ez az élettudományok egyes diszciplináival, köztük az immunológiával is. A jelen kiadásban a helyenként nagyon jelentős módosulások, kiegészítések, sőt cáfolatok két forrásból fakadnak, részben a szűken vett immunológiai tudás gazdagodásából, másrészt a társtudományok (pl. a sejtbiológia, genetika-genomika, bioinformatika) immunrendszerre is vonatkozó eredményeiből. Csak pár példa, a 2007-es kiadásban alig esett szó az extracelluláris vezikulák feladatairól, ezek, az intercelluláris kommunikációs struktúrák mára a sejtbiológia tudományának egyik „forró pontjává” váltak. Akkor sokkal kevesebb hangsúlyt fordítottunk az epigenetikai módosítások jelentőségére és alig esett szó a velünk élő mikrobiális flóra szerepéről. Ma már nem csak sokkal több citokin és kemokin vált ismertté, de funkcióikat is mélyebben értjük. Emellett a CD antigének azonosítása és funkcionális jelentőségükkel kapcsolatos tudásunk is markánsan kibővült.

Hivatkozás: https://mersz.hu/falus-buzas-holub-rajnavolgyi-az-immunologia-alapjai//

BibTeXEndNoteMendeleyZotero

Kivonat
fullscreenclose
printsave